重组人血管内皮抑制素抑制内皮细胞血管生成的实验研究

目的:观察国产重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的抗血管生成作用,并对其机制进行初步探讨.方法:采用MTS/PMS系统测定不同浓度恩度对HUVECs和人肝癌细胞株HepG2的生长抑制作用;流式细胞术检测恩度在相同时间内诱导HUVECs和HepG2细胞早期凋亡和晚期凋亡情况;通过迁移/侵袭实验、体外管腔形成实验和鸡胚尿囊膜(CAM)实验观察恩度对HUVECs迁移/侵袭和体内外管腔形成及功能的影响.结果:不同浓度的恩度持续作用72h,对HUVECs具有抑制增殖,且在50～200ng/ml的剂量范围内呈现浓度依赖关系;而对HepG2细胞未见明显作用.药物处理方式的不同,恩度对HUVECs诱导凋亡和迁移/侵袭作用差异显著;对HepG2细胞的迁移/侵袭未见明显影响.高剂量的恩度对HUVECs体外管腔形成和鸡胚尿囊膜的血管发生及成熟具有显著影响.结论:重组人血管内皮抑制素(恩度)能够有效地抑制血管内皮细胞形成复杂的管腔,并显著影响血管的成熟;对人肝癌细胞系HepG2生长及迁移/侵袭未见明显影响.     

恩度对不同状态内皮细胞表面标记物影响的实验研究

目的:检测恩度对不同生长状态的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用,以及对其表面分子标志物的影响,研究二者的内在联系,初步探讨恩度的作用机制.方法:制备3种生长状态的HUVEC细胞:刚贴壁细胞、对数生长期细胞及经TNF-α250IU/mL作用6h后HUVEC细胞.检测恩度作用于不同生长状态内皮细胞后的分子表面标志物CD105、CD62E变化.探讨各表面标记物与细胞生长的不同状态及其经恩度作用后的变化与其不同作用浓度和时间的关系.结果:恩度作用后HUVEC表面分子标志物的检测结果为:1)CD105变化:刚贴壁HUVEC细胞、对数生长期细胞的表达均随恩度的作用浓度及时间变化下调,有统计学意义(P<0.05).2)CD62E的变化:只在经TNF-α 250IU/mL作用6h后细胞组在恩度作用24h时间段内随恩度浓度增加下调,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组均无显著性差异(P>0.05).结论:一定浓度的恩度可能不足以诱导内皮细胞凋亡,却可以明显抑制其活化,使其转入"静止状态",其活化标记物也随之下调.     

人血管生成素-1对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究

目的:探讨人血管生成素1（angiopoietin1, Ang1）对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell, HUVEC)增殖和凋亡的影响，以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制。方法构建pcDNA3.1 V5HisCAng1真核表达载体，并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法，分析Ang1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下，Ang1对HUVEC凋亡的影响。结果： 成功克隆了Ang1基因，构建了其正义真核表达载体，并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养；MTT法检测HUVEC增殖结果：只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11， 0.40±0.03，0.68±0.10(P<0.05)；细胞计数法检测结果依次为：（10.13±2.06）×104，（8.7±1.73）×104，（15.03±1.98）×104(P<0.05)。流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为： 21%，19%和6%。结论： Ang1能显著促进血管内皮细胞体外增殖，抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡。     

环磷酰胺诱导小鼠HAC肝癌细胞凋亡和抑制增殖的体内实验研究

目的 探讨环磷酰胺对荷瘤鼠ＨＡＣ肝癌细胞凋亡和增殖的影响。方法 建立小鼠ＨＡＣ肝癌荷瘤模型,用ＴＵＮＥＬ法和免疫组化法检测环磷酰胺作用下,ＨＡＣ肝癌细胞的凋亡和ＰＣＮＡ表达的变化。结果 １５ｍｇ／ｋｇ环磷酰胺的抑瘤率４３％。ＨＡＣ肝癌细胞的凋亡指数１．９３％,较荷瘤对照组１．１１％明显升高（Ｐ〈０．０５）。增殖指数３５．７５％,较荷瘤对照组５６．３８％明显下降（Ｐ〈０．０１）。结论 环磷酰胺有诱导     

23-羟基白桦酸抑制血管内皮细胞增殖和诱导凋亡的实验

 目的 研究23-羟基白桦酸（23-hydroxy betulinic acid，23-HBA）对人血管内皮细胞（human microcapillary endothelial cells，HMEC）增殖及凋亡的影响。方法 采用SRB法测定23-HBA对HMEC增殖的抑制率，并用流式细胞术测定23-HBA对HMEC周期及凋亡的影响。结果 23-HBA可明显抑制HMEC的体外增殖，IC50为40．44μg／ml。流式细胞术测定，HMEC出现典型的凋亡峰，其凋亡百分率随着药物浓度的提高而明显升高，与对照组相比，差别有统计学意义。HMEC的S期细胞含量明显上升，而G2／M期细胞含量下降。结论 23-HBA具有明显抑制血管内皮细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。     

靶向survivin的siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡

目的 观察靶向survivin的siRNA对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建靶向survivin的siRNA真核表达载体,采用Lipofectamine^TM2000转染乳腺癌细胞MCF-7,采用半定量RTPCR、免疫组化技术检测转染前后MCF-7细胞survivin基因表达的变化;采用MTT法检测对MCF-7细胞增殖的抑制作用;采用TUNEL法检测诱导MCF-7细胞凋亡的作用。结果靶向survivin的序列特异性siRNA可以高效抑制MCF-7细胞survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为64．9％;在蛋白质水平其表达抑制率为79．7％;转染靶向survivin的siRNA真核表达载体可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,细胞重新接种24、48h后,其增殖抑制率分别为31．6％和33．0％;转染后24h可以诱导12．9％的细胞凋亡。结论利用RNA干扰技术阻断survivin基因的表达可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,靶向survivin的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

RhoC 过表达对人脐静脉内皮细胞体外迁移 及血管生成能力的影响

 目的　探讨RhoC 基因过量表达对内皮细胞体外迁移及血管生成过程的影响。方法　构建 RhoC 真核表达载体,以脂质体转染人脐静脉内皮细胞( HUVE) ,采用RT2PCR 和Western blot 检测 RhoC 的mRNA 及蛋白表达水平; 划痕实验检测细胞迁移能力; 胶原基质胶三维培养检测内皮细胞体 外血管生成能力。结果　转染RhoC 实验组与空载体对照组比较,RhoC mRNA 和蛋白表达明显增高; 细胞迁移能力和血管样结构生成能力明显增强。结论　RhoC 高表达能促进人脐静脉内皮细胞体外迁 移及血管生成。     

金雀异黄酮对同型半胱氨酸诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用

背景与目的:探讨同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV-304的氧化应激损伤及金雀异黄酮(genistein,GEN)对这种损伤的保护作用.材料与方法:以5.0 mmol/L的HCY作用于ECV-304细胞;同时设不同浓度的GEN(10、50、100 μmol/L)保护组,各保护组预先加入GEN孵育12 h后,再加入5.0 mmol/L的HCY.通过四噻氮唑盐(MTT)比色法观察细胞活性,使用流式细胞术检测胞浆活性氧(ROS)水平. 结果:HCY可降低ECV-304细胞的细胞活力,HCY处理后的细胞ROS水平与对照组相比明显升高(P<0.01);经不同浓度的GEN预处理后,细胞活性较单独HCY处理组显著增高(P<0.05),而50和100 μmol/L GEN处理组ROS水平较单独HCY处理组显著降低(P<0.05),且呈现剂量依赖性.结论:HCY可使ECV-304细胞氧化应激损伤,活力下降,而GEN具有抗氧化作用,能降低内皮细胞氧化损伤的程度.     

尼美舒利抑制人食管癌细胞增殖及诱导凋亡

 目的　研究尼美舒利对食管癌细胞株 (Eca 10 9)增殖的影响 ,探讨其可能的作用机制。方法　以人食管癌细胞株作为研究对象 ,采用噻唑蓝 (MTT)法、流式细胞仪 (FCM )、电镜和细胞免疫组化等技术 ,研究尼美舒利对食管癌细胞增殖的抑制和促进凋亡的可能机制。结果　MTT显示尼美舒利对Eca 10 9有细胞毒作用 ,且与药物浓度和作用时间有相关性 (r =0 .976 0 ,P <0 .0 5 )。FCM显示DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰” ,凋亡率在 8.0 1%～ 36 .12 % ,使S期、G2 /M期细胞比例升高 ,G1期比例下降 ,呈一定剂量效应关系。电镜下见典型的细胞凋亡形态学特征 :细胞核染色质致密浓缩 ,凋亡小体形成等。并能在体外抑制食管癌细胞的COX 2和bcl 2表达。结论　体外尼美舒利能抑制人食管癌细胞的增殖 ,可能与诱导细胞凋亡和阻止细胞周期的进展 ,抑制COX 2和bcl 2的表达有关。     

Genistein对人尿道鳞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察Genistein(GEN)对人尿道鳞癌细胞系HUS-98细胞增殖和凋亡的影响.方法MTT法检测细胞增殖,碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC双染色的流式细胞分析方法检测凋亡,台盼蓝拒染法测定淋巴细胞活力,免疫细胞化学检测雌激素受体(ER)蛋白的表达.结果低浓度(1×10-111～1×10-8mol/L)GEN促进HUS-98细胞的生长,处理3 d时,1×10-8mol/L组的细胞数比对照组的增加9%(P＜0.01);高浓度(1×10-7mol/L～5×10-4mol/L)GEN则浓度依赖性地引起HUS-98细胞数目逐日减少,但是除5×10-4mol/L外的其余浓度对正常淋巴细胞的生长没有影响.1×10-6mol/L GEN作用于HUS-98细胞24～48 h,凋亡细胞和坏死细胞的比率均增加,且有时间依赖性.HUS-98细胞表达ER蛋白.结论高浓度GEN具有抑制ER阳性的人尿道鳞癌细胞的生长和诱导凋亡及坏死的作用,为今后用于尿道鳞癌的治疗提供了实验依据.     

Growth Inhibition and Apoptosis Induction of HumanUmbilical Vein Endothelial Cells by Apogossypolone

Aims and Background: Prostate cancer is one of the most common malignant tumors in the male reproductivesystem, which causes the second most cancer deaths of males, and control of angiogenesis in prostate lesions is ofobvious importance. This study assessed the effect of apogossypolone (ApoG2) on proliferation and apoptosis ofhuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Subjects and Methods: HUVECs were treated with differentconcentrations of ApoG2. The survival rate of HUVECs were determined by MTT assay. Utrastructural changesof HUVECs were assessed with transmission electron microscopy. Apoptosis in HUVECs was analyzed by flowcytometry and cell migration by Boyden chamber assay. Matrigel assays were used to quantify the development oftube-like networks. Results: ApoG2 significantly inhibited HUVEC growth even at 24 h (P<0.05). The inhibitoryeffect of ApoG2 is more obvious as the concentration and the culture time increased (P<0.05). These resultsindicate that ApoG2 inhibits the proliferation of HUVECs in a time- and concentration-dependent manner withincrease of the apoptosis rate. Besides, ApoG2 reduced the formation of total pseudotubule length and networkbranches of HUVECs. Conclusions: The results suggest that ApoG2 inhibits angiogenesis of HUVECs by growthinhibition and apoptosis induction.     

芎芍胶囊对人脐静脉内皮细胞NO、iNOS和eNOS表达的影响

背景与目的：观察芎芍胶囊含药血清对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）一氧化氮（nitrogenmonoxidum,NO）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase,iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase,eNOS）表达的影响,探讨芎芍胶囊促血管新生的作用机制。材料与方法：不同芎芍胶囊药物浓度的含药血清（分为4．17、8．33和16．66rag／ml共3组）培养HUVEC细胞24h后,比色法检测培养液中NO、iNOS的含量,RT-PCR检测HUVEC细胞中iNOS、eNOS的表达。结果：4．17mg／ml含药血清组培养上清液中NO含量较对照组增加（P〈0．01）;4．17和8．33mg／ml含药血清组iNOS含量较对照组增加（P〈0．01）。RT-PCR结果显示,4．17mg／ml含药血清组HUVEC细胞的eNOSmRNA和iNOSmRNA的表达均增加（P均〈0．01）,8．33和16．66mg／ml组HUVEC细胞的eNOSmRNA和iNOSmRNA表达均减少（P均〈0．01）。结论：4．17mg／ml芎芍胶囊含药血清组促进血管新生可能与增加iNOS、eNOSmRNA表达,促进NO合成与分泌有关。     

电离辐射对血管内皮细胞和PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨不同剂量X射线照射对原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和PC-3细胞周期和凋亡的影响,为临床放疗提供理论依据。方法 采用形态学观察和Annexin V-FITC联合PI双染法和ApO2.7单抗法流式细胞仪(FCM)定量检测原代HUVEC和PC-3细胞在0-10 Gy的6MV-X射线照射后细胞周期和凋亡的变化。结果 照射后24 h和48 h两种细胞均出现明显G0/G1期减少和G2/M期增加,但2 Gy照射时仅对PC-3细胞周期有影响;两种细胞照射后均未出现辐射相关的凋亡。结论 电离辐射可诱导两种细胞出现G2/M期阻滞但不引起凋亡发生,两种细胞均有一定的辐射抗拒性。     

褪黑素对肺癌A549细胞诱导的血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨褪黑素在体外共培养条件下对肺腺癌A549细胞诱导血管内皮细胞增殖的影响及相关机制。方法建立肺腺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECS）ECV-304共培养模型,实验共分成四组：Con组(对照组),nM组(褪黑素终浓度1 nM/L),μM组(褪黑素终浓度1 μM/L),mM组(褪黑素终浓度1 mM/L)。采用BrdU法观察不同浓度褪黑素对血管内皮细胞（ECV-304）增殖的影响,细胞迁移实验观察褪黑素对血管内皮细胞活力的抑制作用,ELISA法检测褪黑素对肺腺癌细胞VEGF蛋白表达的影响。结果低浓度的MLT(1 nM/L)对HUVECs增殖无明显影响,但高浓度 MLT(1 mM/L)明显抑制HUVECs增殖,并有浓度依赖倾向; 高浓度的褪黑素明显降低肺腺癌A549细胞培养液中VEGF的表达。 结论高浓度的褪黑素可以抑制肺腺癌细胞诱导的血管内皮细胞的增殖及迁移,其作用机制可能与褪黑素抑制肺腺癌细胞VEGF的表达有关。     

原代培养人脐静脉内皮细胞电离辐射效应的初步研究

目的 :初步探讨人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)原代培养的电离辐射效应。方法 :HUVEC经体外原代培养并用电镜及免疫组化法鉴定 ;形态学观察和流式细胞仪 (FCM )测定单次 6MV X射线照射 0～10Gy后 2 4和 4 8h细胞周期和凋亡 ;放免法和硝酸还原酶法分别测定内皮素 (ET 1)及一氧化氮 (NO)代谢产物NO-2 的含量。结果 :按本法原代培养的HUVEC生长良好 ,并证明是血管内皮细胞 ;FCM经 5和 10Gy照射后 2 4及 4 8h出现明显G0 G1期细胞比例减少 ,G2 M期增加及分泌ET 1减少 ,但无照射引起的细胞凋亡和NO分泌的变化。结论 :本方法原代培养的HUVEC经鉴定确为人血管内皮细胞 ,生长汇合后有一定的辐射抗拒性。     

彗星电泳法和K-SDS法检测甲醛和H2O2对人脐静脉内皮细胞DNA的损伤

背景与目的: 研究甲醛、H2O2以及两者共同作用对人脐静脉内皮细胞DNA的损伤.材料与方法: ①应用彗星电泳法于荧光显微镜下观察人脐静脉内皮细胞经甲醛、H2O2、甲醛和H2O2不同浓度(0、5、10、25、50、100 μmol/L)作用20 min或25 μmol/L浓度作用不同时间(0、10、20、30 min)后的DNA损伤情况;②用K-SDS法检测甲醛、甲醛和H2O2不同浓度(0、10、50、100、500、1 000、 2 000 μmol/L)或50 μmol/L、100 μmol/L浓度不同时间(0、0.5、1、1.5、2、4 h)引起的DNA-蛋白质的交联效应. 结果: ①彗星电泳结果:内皮细胞与不同浓度甲醛孵育20 min,5、10、25 μmol/L甲醛所致DNA损伤以断裂为主且与阴性对照有统计学意义(P<0.05);与等摩尔H2O2共同孵育时,5、10、25 μmol/L浓度组均可使单独H2O2作用时的彗星尾距增加,50、100 μmol/L使单独H2O2作用时的彗星尾距减小;25 μmol/L甲醛作用不同时间,尾距随时间增加而增大(P<0.05).②交联结果:内皮细胞与不同浓度甲醛孵育1.5 h后,引起DNA-蛋白质交联(DPC)形成明显增高(P<0.05);与等摩尔H2O2共同孵育时除1 h组(P<0.05),其余各组与阴性对照无统计学差异;50 μmol/l的甲醛作用不同时间,2 h组与阴性对照有统计意义(P<0.05);100 μmol/L的甲醛、甲醛与H2O2作用不同时间,各实验组与阴性对照无统计学意义. 结论: ①在体外条件下,低浓度甲醛(<25 μmol/L)对DNA的损伤以断裂为主,高浓度(>500 μmol/L)以交联为主,均呈剂量及时间依赖性;②H2O2引起内皮细胞DNA断裂损伤,呈剂量及时间依赖性.     

特异性核酶诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的：研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法：设计特异性切割HPV16E6基因的核酶,构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。Northern杂交细胞3种细胞中E6基因的表达。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率,并测定HPV16E6,c-myc,bal-2,p53,fas等蛋白的表达。将3种细胞在相差显微镜和荧光显微镜下观察,采用荧光（Hoechst33342）染色和TUNEL（TDT-mediated dUTP nick end labelling）2种方法测定细胞凋亡。结果：Northern杂交证实CaSKi-P中表达E6较CaSKi-P,CaS-Ki明显降低。与CaSKi-R细胞表达HPV16E6,c-myc,bcl-2蛋白明显减少,而表达p53明显增高;两者中fas蛋白的表达相近。CaSKi-P细胞中各基因的表达与CaSKi细胞无显著差异。结论：抗HPV16E6-Ribozyme的导入能诱导宫颈癌细胞凋亡,其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低,以及由此而引起的细胞内一系列基因表达的改变。     

冬凌草甲素诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究

目的　观察冬凌草甲素体外诱导人结肠癌HCT8细胞凋亡的作用。方法　利用光镜及流式细胞仪观察不同浓度冬凌草甲素诱导结肠癌HCT8细胞凋亡的作用。结果　冬凌草甲素可诱导HCT8细胞凋亡 ,且凋亡率随着浓度的增加而增加。结论　冬凌草甲素对HCT8细胞株具有体外抗肿瘤作用 ,其作用机制与诱导凋亡有关     

脐带静脉移植建立髂内动脉化疗通道的实验研究

用醛化人脐带静脉移植犬髂内动脉建立可供长期穿刺的皮下给药通道。结果２６只犬移植的脐静脉，３个月通畅率为８８．５％（２３／２６），走行于皮下的脐静脉搏动感良好。病理检查显示，多数移植的脐静脉内壁光滑、平整，两端吻合口有内膜生长，并向脐静脉内壁延伸，逐渐替代纤维素膜。本研究表明，脐带静脉可作为动脉移植代用品，建立髂内动脉化疗通道是可行的。