RPS14基因RNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干/祖细胞内RPS14表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。 目的：构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。 方法：针对已经筛选确定的RPS14基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPS14慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度;并将获得的RPS14shRNA慢病毒载体GC-shRPS14转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用Western Blot检测靶细胞内RPS14蛋白的表达。 结果与结论：经测序证实,构建出了RPS14shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×109 TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75%,Western Blot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPS14蛋白表达沉默。     

Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

用慢病毒载体介导的RNAi感染CB3细胞后抑制FLI-1的表达

 【摘要】目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)方法对小鼠红白血病细胞（CB3）中FLI-1（Friend leukemia integration-1,FLI-1）基因表达的抑制作用,以为后续实验提供有力的技术支持。方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况。RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达。结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/ml,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组（P<0.001）。结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达,为后续实验提供稳定的感染细胞载体。     

TCAB1基因RNAi慢病毒载体的构建及在人子宫内膜间质细胞中沉默TCAB1基因的效应

目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确定的TCAB1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoI和HpaI酶切后的LV1载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV1-shRNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV1-shRNA、pRev、pVsvg、pcgv四质粒共转染包装细胞HEK-293T细胞,包装产生慢病毒,分别于转染后48h、72h收取病毒上清,感染人子宫内膜间质细胞(ESC),进行RT-qPCR检测TCAB1基因相对表达量,检测LV1-shRNA干扰效率。结果 PCR和测序证实,成功构建TCAB1 shRNA的慢病毒载体LV1-shRNA。结论成功构建TCAB1基因的RNAi慢病毒载体,其转染ESC细胞后显著抑制了TCAB1的表达,为子宫内膜异位症的基因靶向治疗提供了实验基础。     

增殖抑制基因（HSG）RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定

目的为研究HSG基因不同表达程度对肺癌细胞的影响,构建并鉴定HSG基因RNA干扰慢病毒表达载体,以建立HSG基因沉默的人肺癌细胞株。方法针对HSG mRNA设计了4条siRNA,并构建p GCSIL-GFP-HSG慢病毒质粒,通过测序鉴定。采用构建的p GCSIL-GFP-HSG,p Helper1.0和p Helper2.0共感染293T细胞,包装产生慢病毒,测定其滴度。将慢病毒转染人肺腺癌细胞株A549,通过real-time PCR分析HSG基因表达。结果测序结果显示,DNA序列与实验要求序列一致,提示插入人HSG基因RNAi序列正确。荧光显微镜观察转染慢病毒包装质粒后的细胞,见细胞生长良好,荧光强度强烈。测定病毒滴度为3×108TU/ml。real-time PCR分析提示RNA干扰病毒感染A549细胞株后,HSG基因表达显著下调。结论人HSG基因RNAi慢病毒载体构建成功,可用于肿瘤学的进一步应用。     

Beclin1基因siRNA慢病毒载体构建和鉴定

本研究通过慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti)构建靶向Beclin1基因的RNA干扰(RNAi)重组体,用以建立Beclin1基因稳定沉默的非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株。PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pRNAT-U6.2/Lenti载体;测序结果证明3个重组慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti-si356、pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pRNAT-U6.2/Lenti-si684的插入序列完全正确;重组慢病毒载体感染A549细胞后,RT-PCR和Westernblot检测结果均证实3组重组体感染的细胞内Beclin1mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,Beclin1mRNA的沉默效率分别为35.56%、89.22%和66.78%。结果显示成功构建了Beclin1基因的RNAi病毒重组载体,并建立了其稳定表达的NSCLC A549细胞株,为探讨Beclin1基因对NSCLCA549细胞生物学行为的影响提供了新的细胞模型。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为10⁶ TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.     

靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpin RNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF1)基因的沉默效果.方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1.以人HIF1 cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1.新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变.结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降.结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义.     

靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平.     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

携带小鼠IGF-1基因的慢病毒载体构建及其在神经干细胞中的表达

目的:构建含有小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的慢病毒载体,鉴定其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法:采用RT-PCR方法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增IGF-1基因,克隆入pcDNA3.1质粒,构建慢病毒载体pXZ9-IGF-1。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,获得病毒上清。分离培养神经干细胞,Nestin免疫荧光化学鉴定。慢病毒感染神经干细胞,显微镜下观察GFP表达情况,通过RT-PCR及ELISA试剂盒分别从mRNA和蛋白水平检测IGF-1的表达。结果:通过RT-PCR法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增出IGF-1基因并克隆入pcDNA3.1载体,经亚克隆成功构建慢病毒质粒pXZ9-IGF-1。质粒经脂质体转染293FT细胞获高滴度慢病毒颗粒,体外高效感染神经干细胞。神经干细胞经感染后,IGF-1基因mRNA和培养基中蛋白水平均高表达。结论:成功构建含小鼠IGF-1基因的慢病毒载体pXZ9-IGF-1,并在神经干细胞内获得表达。     

抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建抗mdr1 RNA干扰真核表达栽体。方法：根据Reynolds的设计原则．针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1栽体中．转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果：用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论：通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致．预期可用于逆转mdr1所致耐药。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW。方法 XhoI线性化pLenti-EF1a-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI,接着BamHI酶切该片段,回收2722bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoRI线性化pFUGW,回收并补平EcoRI,然后BamHI酶切该片段,回收9174bp片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionI将其与连接用c-Myc-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUMGW。获pFUMGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒感染人胚肾细胞株293、肿瘤细胞株CNE1和C666以建立相应的病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUMGW,按标准程序生产的携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染293、CNE1和C666。结论成功构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW,为相关后续研究打下了良好基础。