分离日本血吸虫感染小鼠模型肝星状细胞的改良方法

目的提供适用于日本血吸虫感染小鼠模型活化后肝星状细胞分离的新方法,并确定最适宜的密度分离液浓度。方法构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,对小鼠模型分别进行经下腔静脉逆行灌注和门静脉顺行灌注,充分完全消化小鼠肝脏,获得肝脏细胞悬液。利用Optiprep密度梯度离心法逐步纯化获得活化的原代肝星状细胞。通过流式分选法和Real-time PCR验证实验结果,统计分析通过不同浓度分离液密度获得的肝星状细胞数量和纯度。结果当分离液密度分别为13.5%、15.0%、16.5%和18.0%时,富集到的肝星状细胞数量依次升高,肝星状细胞的纯度分别可达56.1%、90.3%、75.9%和71.1%。比较流式分选法得到的细胞与本实验得到的原代肝星状细胞纯度,二者间差异无统计学意义(P0.05)。结论改良后的实验方法可在日本血吸虫感染小鼠模型中高产量地分离出活化的高纯度原代肝星状细胞,且更加经济便捷、实验结果稳定。     

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

目的 探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法.方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC,并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度.结果3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1,(3.66±0.4)×106g-1,(10.3±0.7)×106 g-1;细胞纯度分别为(93.2±1.7)％,(90.7±1.5)％,(94.5±1.9)％.结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法.     

日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞差异表达microRNA的鉴定

目的 筛选并验证在感染日本血吸虫小鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中差异表达的microRNA(miRNA)。方法 12只6周龄的BALB/c雄性小鼠随机分为正常对照组和感染日本血吸虫组,其中对照组3只,感染组9只。采用Ⅳ型胶原酶体外灌注、密度梯度离心和CD11b磁珠阴性分选相结合的方法,分离小鼠肝脏中的原代HSC。取正常小鼠和感染血吸虫后第42天、49天、56天小鼠的原代HSC样本进行miRNA高通量测序,筛选感染后差异表达的miRNA,并利用定量PCR（quantitative PCR, qPCR）技术验证测序结果。结果 通过miRNA测序,筛选出感染后HSC中差异表达的宿主miRNA共89条,其中75条表达上调,14条表达下调;qPCR验证部分表达改变miRNA的结果显示,miR-17-5p、miR-21a-5p、miR-25-3p、miR-100-5p、miR-122-5p的表达趋势与测序结果基本一致。结论 日本血吸虫感染导致宿主HSC部分miRNA表达谱发生了明显改变,这些差异表达的miRNA在血吸虫病肝纤维化进展中起着重要调控作用,其可能在肝纤维化发生发展过程中参与对某些信号通路的调控,确切机制需进一步深入研究。本研究结果为这些miRNA在血吸虫病肝纤维化中的功能及其机制研究提供重要基础。     

大鼠原代肝星状细胞的分离方法研究

目的 探讨分离肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的有效方法.方法 采用链霉蛋白酶E (pronase E)和胶原酶(collagenase)灌注消化大鼠肝脏,12%Nycodenz密度梯度离心方法分离大鼠原代肝星状细胞.结果 原代肝星状细胞的细胞得率4×107/只大鼠,纯度为95%~98%,存活率96%.结论 肝脏消化酶灌注结合Nycodenz密度梯度离心是一种稳定的分离培养肝星状细胞的方法.     

原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞

目的：为深入探讨肝纤维化的细胞机制，探索经济、稳定的肝星状细胞分离和培养方法。方法：采用胶原酶原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞，１８％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心纯化星状细胞。结果：星状细胞的得率为１×１０７～３×１０７／肝，纯度为９０％，存活率为９６％。结论：原位循环灌流法是有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。     

CD11c细胞的改良法磁珠分离及诱导T细胞增殖研究

目的:改良CD11c细胞的磁珠分离方法,并观察CD11c细胞诱导同源CD4 T和CD8 T细胞增殖的作用.方法:使用胶原酶、DNase I和EDTA处理脾组织,以及小鼠血清和抗CD16/32抗体阻断CD11c磁珠与脾细胞非特异结合后分离CD11c细胞:流式细胞术分析CD11c细胞的纯度;淋巴细胞混合培养和ELISA检测CD11c细胞诱导同源T细胞增殖及分泌细胞因子的作用.结果:改良后的磁珠分离法获得了平均(4.52±0.05)×106/鼠的CD11c细胞,纯度高达98%.重组肿瘤疫苗E.coli LLO/OVA免疫小鼠的CD11c细胞明显促进了CD4 T和CD8 T细胞增殖并分泌IL-2和IFN-γ.结论:改良法磁珠分离获得了较多高纯度的CD11c细胞,活化的CD11c细胞具有诱导同源T细胞增殖及分泌细胞因子的作用.     

大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

目的：探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法：采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心（20000r/min）和细胞悬液低速离心（40×g）去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果：肝星状细胞的得率为（3.6±0.1）×10^7/肝,肝星状细胞存活率为（92.8±0.8）%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为（96.2±0.5）%。结论：本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的：建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）分离方法。方法：运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果：我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论：本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。     

两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较

目的比较Ficoll-Paque梯度离心法与免疫磁珠法分离T淋巴细胞的效果差异,筛选有效的、优异的分选小鼠脾原始T淋巴细胞方法。方法分别采用Ficoll-Paque梯度离心法及Miltenyi Biotec免疫磁珠进行小鼠淋巴细胞分离。血小板计数器统计单核淋巴细胞数,苔盼蓝染色判断细胞存活率,流式细胞术鉴定CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度,并进行统计学分析。结果免疫磁珠法CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度较高为（66.27±3.52）%,Ficoll-Paque梯度离心法细胞纯度为（15.27±4.16）%,两者比较差异有统计学意义（P〈0.01）;但Ficoll-Paque梯度离心法获取淋巴细胞数（1.47±0.35）×10^8较免疫磁珠法的（0.67±0.26）×10^8多,两者比较差异有统计学意义（t=8.199,P〈0.01）,且Ficoll-Paque梯度离心法细胞存活率（93.9±2.6）%较免疫磁珠法的（89.9±2.9）%高,两者比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）。结论免疫磁珠法适合分离小鼠脾原始T淋巴细胞并用于细胞纯度要求高的免疫学实验,但细胞得率需进一步优化。     

慢性阻塞性肺病患者外周血中0D34^＋细胞数量变化

目的：观察中、重度慢性阻塞性肺病（COPD）患者外周血中CD34^＋细胞数量变化。方法：按入选标准收集25例中、重度COPD患者外周血,应用密度梯度离心法分离单个核细胞,采用CD34^＋正分选试剂盒进行磁珠纯化,用流式细胞分析仪分析其纯度,同时对入选患者行常规心电图、肺功能、心动超声及血气检查。同期16例性别、年龄无差异志愿者作为对照组,入选标准：年龄〈70岁;肺功能正常;没有临床症状;无吸烟史。结果：经过分离纯化可得到93％表达CD34^＋细胞。COPD患者组与对照组外周血中的CD34^＋细胞数分别是（19．99±11．11）×10^4、（32．75±18．25）×10^4,患者组CD34^＋细胞数明显少于对照组（P〈0．05）,CD34^＋细胞数与患者病程呈负相关（r=-0．689,P〈0．05）。结论：COPD患者外周血中CD34^＋细胞数降低,与患者病程呈负相关。     

哮喘小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞与气道炎症反应的关系

目的 观察哮喘小鼠外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg）数量的改变及其与气道炎症反应的关系。方法健康6周龄SPF级BALB/c小鼠20只,随机分为2组：正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）,B组以卵白蛋白（OVA）致敏激发方法建立小鼠哮喘模型;流式细胞术检测小鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg占淋巴细胞的比例;检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）炎症细胞数;BALF炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞数分别与外周血CD4^＋CD25^＋Treg作相关分析。结果A组、B组小鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg占淋巴细胞比例分别为（5．81±0．76）％、（3．21±0．74）％,差异有统计学意义（P〈0．05）BALF炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞数与外周血CD4^＋CD25^＋Treg呈负相关,相关系数分别为-0．929和-0．920。差异有统计学意义（P〈0．001）结论哮喘小鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg占淋巴细胞比例较正常对照组显著减少。且与哮喘小鼠气道炎症反应密切相关。     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞在原发性肝细胞癌肿瘤侵袭性、进展以及预后中的价值。方法应用三色免疫荧光标记法通过流式细胞仪对45例来自不同分期的原发性肝癌患者外周血、肿瘤组织和30例正常人外周血CD4^＋、CD8^＋、CD4／CD8、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD25^＋CTLA4^＋ -T淋巴细胞亚群的比例进行分析比较,以说明原发性肝癌患者的细胞免疫功能状态。结果①原发性肝癌患者外周血淋巴细胞总数及CD4^＋T细胞比例、CD4／CD8比例低于正常对照组[分别为（1．5±0．4）×10^9,（2．1±0．4）×10^9;（27．6±3．3）％,（32．9±5．8）％;1．02±0．26,1．31±0．42]。②原发性肝癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋ -Treg及CD4^＋CD25^＋CTLA4^＋ -T细胞占CD4^＋T细胞的比例明显高于正常对照组[分别为（19．2±3．3）％,（8．4±2．5）％;（8．6±2．2）％,（2．1±0．8）％]。原发性肝癌患者不同分期之间上述比例差异有统计学意义（P〈0．05）。③肿瘤组织中CD4^＋CD25^＋CTLA4^＋ -T细胞比例明显高于肿瘤患者外周血中所占的比例（分别为（87．1±4．4）％,（57．3±3．3）％）。结论调节性T细胞在原发性肝癌患者中的数量分布与肿瘤临床分期有明显关系,CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量的增多可以作为判断侵袭性、进展的一个潜在重要指标。     

人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞组份中高增殖潜能集落形成细胞及其表型特征的初步探讨

目的研究人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞亚群中高增殖潜能集落形成细胞（HPP—CFC）频率及表型特征。方法采用机械法制备人胎盘组织（PT）游离细胞悬液,用Histopaque-1077分离出单个核细胞（MNCs）,经磁式分选（MACS）分离纯化CD133^＋和CD133^-细胞。将分选的CD133^＋和CD133^-细胞分别使用H4435培养基培养4wk后观察HPP—CFC集落形成能力,用流式细胞仪（FCM）对分选的细胞组份和HPP—CFC进行表型分析。结果培养4wk后,PT—CD133^＋、CD133^-细胞生成的HPP—CFC集落分别为32．4±11．2／5×10^3,2．0±2．3／5×10^3,前者细胞中HPP—CFC数量明显高于后者（P〈0．01）;PT—CD133^＋、CD133^-细胞培养至28d时CD133^＋CD34^＋,CD133^＋CD34^-和CD133^-CD34^＋亚型均比培养前减少。结论人胎盘组织CD133^＋与CD133^-细胞群中均存在HPP—CFC,但CD133^＋细胞群中的HPP—CFC明显多于CD133^-细胞群,说明胎盘CD133^＋细胞群中存在更多的早期HSPC。     

室温酶解结合差速离心法分离子宫内膜腺上皮细胞及活性评估

目的 探讨室温酶解结合改良式差速离心法分离培养人子宫内膜腺上皮细胞的效果及细胞活性评估.方法 选择子宫腺肌症患者在位增殖晚期及分泌期内膜10例,所得内膜分为两份,一份采用室温酶解结合改良式差速离心法（改良组）分离,一份采用37℃水浴消化结合筛网法（对照组）分离,通过细胞计数、细胞免疫化学及MTT法分别比较两种方法分离培养子宫内膜腺上皮细胞的数目、纯度及细胞生长活性.结果 两组中10份标本均获得成功;改良组每g内膜组织可得到（9±1.7）×10^7个腺上皮细胞,免疫细胞化学角蛋白表达阳性,纯度达（97.8±0.002）％;对照组可得到（3.9±0.78）×10^7个腺上皮细胞,角蛋白表达阳性,纯度达（88.6±0.006）％,改良组分离的腺上皮细胞数量和纯度均明显高于对照组（P＜0.05）.MTT结果显示改良组细胞在对数生长期生长活性明显高于对照组（P＜0.05）.结论 采用室温酶解结合改良式差速离心法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞,并且细胞数量多,活性好,可用于子宫内膜疾病的药物干预及机制学的研究.     

OK432-肿瘤疫苗对DBA/2小鼠外周血中T细胞亚群的影响

目的探讨OK432-肿瘤疫苗对小鼠外周血T细胞亚群的影响。方法将36只DBA/2小鼠随机分为OK432-肿瘤疫苗组、OK432组及正常组,每组12只。培养细胞,制作疫苗后,对三组小鼠分别腹腔注射OK432-肿瘤疫苗、OK432及磷酸盐缓冲液（PBS）,每周1次,连续3周。然后分别在1、3、7 d时眼球采血,利用流式细胞术检测外周血中的T细胞亚群的含量,采用SPSS 17.0软件进行数据处理。结果免疫后第3天,OK432-肿瘤疫苗组、正常组、OK432组CD3＋T细胞平均值分别为（55.31±2.06）%、（48.81±3.60）%、（47.21±3.51）%;CD4＋T细胞平均值分别为（40.55±2.32）%、（34.91±1.04）%、（34.24±0.95）%;OK432-肿瘤疫苗组与正常组及OK432组CD3＋、CD4＋T细胞差异均有统计学差异（P〈0.05）。免疫后第7天,OK432-肿瘤疫苗组、正常组CD3＋T细胞平均值分别为（36.26±1.98）%、（23.72±1.90）%;CD4＋T细胞平均值分别为（27.11±0.87）%、（15.42±2.87）%;CD4＋/CD8＋的平均值分别为（3.47±0.33）%、（2.91±0.52）%,差异均有统计学差异（P〈0.05）;OK432-肿瘤疫苗组、OK432组CD8＋T细胞的平均值为（7.85±0.98﹚%、（5.48±0.40）%,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 OK432-肿瘤疫苗能够有效增强小鼠的细胞特异性免疫能力。     

一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

目的 探讨一种高效、经济、稳定的肝星状细胞的分离方法,为肝纤维化研究提供细胞模型.方法 应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流,以Nycodenz为分离介质,采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞.结果 肝星状细胞的获得率为（3.2±0.67）×107/只、存活率为90%以上.结论 该法是一种较理想的分离肝星状细胞的方法.     

系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的研究

目的：测定系统性硬皮病患者外周血中的内皮祖细胞（endothelial progenitors cells,EPCs）数量和增殖、迁移、黏附功能,探讨EPCs在其发病中的作用。方法：系统性硬皮病患者和健康者各20例。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞并培养,流式细胞仪检测CD133^＋、CD34^＋或CD133^＋、VEGFR2^＋双荧光标记的EPCs数。MTT比色法、Millicell小室和黏附能力测定实验分别检测EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果：系统性硬皮病患者外周血EPCs数为（0．10±0．09）％,健康对照组为（0．49±0．09）％,P〈0．01,系统性硬皮病患者外周血EPCs数较健康者减少。实验组外周血EPCs增殖、迁移和黏附能力分别为（13．01±4．33）％、（7．20±3．67）个／视野和（15．20±4．40）个／视野,健康对照组分别为（23．28±4．34）％、（14．15±2．98）个／视野和（24．80±3．58）个／视野,两组比较,P值均〈0．01,实验组EPCs增殖、迁移和黏附能力均较对照组有所下降。结论：系统性硬皮病患者外周血EPCs数量减少,增殖、迁移和黏附功能降低,可能参与了系统性硬皮病的发病。