猪细小病毒NS1蛋白65-133位氨基酸缺失对其核定位的影响

为了探究猪细小病毒NS1蛋白入核机制,通过生物信息学网站预测PPV NS1核定位序列,根据GenBank上传的PPV非结构蛋白NS1的序列设计NS1扩增引物和一系列重叠PCR引物,以河南省动物性食品安全重点实验室保存的猪细小病毒DNA为模板,扩增NS1和缺失突变体基因,构建真核表达重组质粒pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS1_(65-133aaDel)、pCAGGS-HA-NS1_(207-267aaDel)。将其转染至PPV易感猪源细胞系PK-15细胞,通过免疫荧光和Western-blot鉴定NS1和不同的NS1缺失突变体在细胞内的核定位情况。结果表明,pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS1_(65-133aaDel)、pCAGGS-HA-NS1_(207-267aaDel)编码蛋白均成功表达。免疫荧光和Western-blot显示NS1和NS1_(207-267aaDel)蛋白定位于细胞核,而NS1_(65-133aaDel)蛋白的细胞定位较NS1发生改变,由细胞核定位改变为细胞质定位,说明PPV NS1蛋白65-133位氨基酸缺失能改变其在细胞内的核定位,PPV NS1蛋白核定位序列NLS存在于NS1的65-133aa处。     

猪细小病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank发表的猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)中国株基因序列设计引物,通过PCR方法扩增到了PPV LJL12株NS1全长基因,将其克隆到原核表达载pET30a( )上,成功构建原核表达载体pET30a-NS1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为86 ku,与预期大小相符;Western blot分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性.NS1在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性,可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测.     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备及抗原表位区分析

采用杂交瘤细胞融合技术,获得3株能稳定分泌抗GPV特异性抗体的杂交瘤细胞株,免疫印迹结果表明:这3株单抗均能与纯化的GPV病毒子及重组VP3蛋白发生特异性反应,而与鸭肝炎病毒、鸭细小病毒、鹅源新城疫病毒无交叉反应。采用真核表达载体pCAGGS对VP3基因进行分段克隆并转染COS-1细胞表达,用单抗介导的间接免疫荧光(IFA)进行检测,结果表明:3E8株单抗与VP3蛋白135～332氨基酸(aa)和322～535aa肽段均能发生特异反应,因此可以推定3E8株单抗识别的抗原表位在VP3的322～332aa上。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆与原核表达

 根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

细小病毒非结构蛋白NS1功能的研究进展

介绍了细小病毒非结构蛋白NS1的生化特性,综述了近年来NS1蛋白与病毒复制、宿主细胞凋亡之间以及与基因表达调控之间的关系,并对NS1蛋白的进一步研究提出了建议。     

基于非结构蛋白NS1结构预测解析猪细小病毒致病性差异

为了探讨猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)不同毒株致病性差异的原因,利用生物信息学在线软件比较PPV NADL-2株和Kresse株的非结构蛋白NS1的氨基酸位点差异,并利用一系列在线软件比较两者的氨基酸理化性质、亲水/疏水性、跨膜区、信号肽的异同,进一步分析两者的结构域、二级结构、三级结构的异同。结果表明,2种毒株在621—636位的氨基酸存在较大差异,Kresse株的疏水性较弱,且二级结构中Kresse株含较多的卷曲结构。经过三级结构比对,并结合以上结果推测,2种毒株致病性差异是由于621—636位未知功能的结构域不同所致。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪萨佩罗病毒(PSV)是一种小RNA病毒,在临床上多与猪流行性腹泻病毒、捷申病毒等引起混合感染.近年来,我国多个省份报道在猪体内分离到该病毒,因而有必要加强对PSV的相关研究.参照PSV-HuN2株序列,将VP1基因插入pGEX-6p-1中进行重组蛋白表达.将蛋白质溶液与弗氏佐剂混合,按照标准程序免疫6～8周龄BALB...     

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株（PPV-N株）的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列（登录号NC_001718）设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21（DE3）pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

Jo-1蛋白在大肠杆菌中的克隆与表达

构建在E.coli中表达人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)的质粒。用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,将此片段定向克隆到麦芽糖融合蛋白表达载体pMAL-c中,诱导表达获得Jo-1的可溶性融合蛋白,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验表明,表达的融合蛋白能与含有抗Jo-1抗体的病人血清发生特异反应,重组融合蛋白具有Jo-1蛋白的免疫原性和免疫特异性。     

不同代次的猪细小病毒(PPV S-1株)NS1基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪细小病毒PPVNADL-2株NS1基因序列设计了一对引物,以PPVS-1分离株不同传代代次的DNA为模板．进行PCR扩增。将扩增产物分别克隆到pGEM．T载体中进行测序。结果表明：扩增片段长约2．2kb。包含完整的NS1基因,共编码662个氨基酸。应用DNAStar软件进行序列分析,结果显示：所有代次的NS1核苷酸同源性在99．4％以上,氨基酸同源性在98．5％以上;PPVS-1分离株在传代致弱的过程中,NS1基因出现了一些变异,有4处较为一致的突变,即1052位C→T、1636位G→A、1717位A→G、1732位T→G．对应的氨基酸变化分别为Thr^351→Met^351、Val^546→Met^546、Asn^573→Asp^573、Set^579→Ala^579．这可能是PPVS-1在ST细胞上传代致弱的分子基础之一。     

NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

 用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1'、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1'、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1蛋白二级结构及B细胞抗原表位预测

以PPV—N株的VP1蛋白基因序列为材料,采用Chou—Fasman、Garnier—Robson和Karplus—Schultz预测VP1蛋白的二级结构,用Kyte—Doolittle法预测VP1蛋白的亲水性,用Emini法预测VP1蛋白的表面可能性,用Jameson—Wolf法预测VP1蛋白的抗原指数,然后综合分析VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PPV—N株VP1蛋白的二级结构以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。本研究为PPV—N株的自然弱毒分子机理以及反向疫苗学研究提供了一定的理论依据。