引起血流感染的耐万古霉素肠球菌基因型、 毒力及MLST分型研究

目的 调查引起血流感染的耐万古霉素肠球菌 (VRE) 的检出情况,并对其进行耐药基因型、毒力和多位点序列分型 (MLST) 研究。 方法 收集2012年7月~2015年7月从笔者医院血培养阳性标本中分离的68株屎肠球菌和28株粪肠球菌,采用含6μg/ml万古霉素的脑心浸液平皿筛选VRE。采用多重PCR法检测vanA、vanB及粪、屎肠球菌种特异基因,另一种多重PCR法检测常见5种毒力基因 (esp、hyl、gelE、asa1和cylA)。采用MLST技术分析菌株序列型 (ST) 从而进行同源性分析。 结果96株肠球菌中共检出22株VRE (22/96,2.9%),包括20株屎肠球菌 (20/68,9.4%) 和2株粪肠球菌 (2/28,7.1%)。所有VRE耐药表型与基因型一致,属vanA型。20株屎肠球菌VRE仅esp (16/20,0.0%) 和hyl (10/20,0.0%) 阳性;2株粪肠球菌VRE仅gelE和 asa1阳性。20株屎肠球菌VRE分属7个ST型,包括8株ST78 (8/20,0.0%)、6株ST17 (6/20,0.0%) 以及2株ST18和ST389、ST414、ST571、ST564各1株。 结论 笔者医院VRE耐药问题严重,耐药基因和毒力基因携带率高。20株屎肠球菌VRE经eBURST软件分析均属于与医院感染相关的CC17克隆复合群。     

氢氧化钙对粪肠球菌生物膜形成相关毒力因子作用的研究

目的：研究粪肠球菌毒力因子gelE、cylA、ace、esp在氢氧化钙作用粪肠球菌生物膜后的表达情况。方法体外建立对数期、稳定期、饥饿期粪肠球菌生物膜模型,以氢氧化钙作用于粪肠球菌生物膜后用qRT-PCR检测毒力因子gelE、cylA、ace、esp的基因表达相对量。结果氢氧化钙作用后,gelE、cylA、ace、esp基因表达相对量,饥饿期高于稳定期及对数期;饥饿期gelE基因表达相对量高于esp,也高于cylA及ace,差异具有显著性意义（ P＜0．05）。结论氢氧化钙作用生物膜可抑制粪肠球菌毒力因子gelE、cylA、ace、esp的表达。     

肠球菌毒力岛基因的检测

目的 探索肠球菌中毒力岛基因的存在情况.方法 使用PCR和杂交方法对155株肠球菌进行毒力岛相关基因检测.结果 155株肠球菌中,88.39%携带至少一个毒力岛基因,各基因阳性率由高至低依次为hyd(81.94%),psaA(78.06%)、nuc(57.42%)、esp(53.55%)、cylB(52.90%)和gls24-lik e(38.06%);除esp基因,其他5个基冈的阳性率均是粪肠球菌高于屎肠球菌,其中nuc、cylB、gls24-like三个基冈的阳性率有统计学差异.粪肠球菌中临床分离株各基因的阳性率和所携带的基冈数均高于健康人分离株.结论 肠球菌普遍携带毒力岛相关基因,粪肠球菌各基因阳性率高于屎肠球菌,粪肠球菌中临床分离株所携带的毒力基因、毒力岛基因数目均明显高于健康人分离株.     

185株粪肠球菌与屎肠球菌的临床分布及耐药性分析

目的 了解2009至2011年安徽地区粪肠球菌与屎肠球菌的临床分布及耐药情况,为临床合理用药提供参考证据.方法 185株粪肠球菌与屎肠球菌药敏试验采用琼脂稀释法,结果依据CLSI 2010年推荐的标准进行判读.结果 3年临床分离菌株共185株,其中粪肠球菌92株,屎肠球菌93株,主要分离于尿液及分泌物,其中粪肠球菌分别占63.4%和11.8%,屎肠球菌分别占48.9%和16.3%;粪肠球菌对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星的敏感性高于屎肠球菌,屎肠球菌对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的敏感性高均达90%以上,粪肠球菌对三者的敏感性均在90%左右,然而无论粪肠球菌和屎肠球菌对红霉素的耐药性均很高,分别为76.3%和92.6%.结论 粪肠球菌与屎肠球菌对不同的抗菌药物的敏感性不同,临床上应加强对粪肠球菌和屎肠球菌的监测及抗菌药物使用的管理,预防和减少耐药菌株的产生.     

粪肠球菌和屎肠球菌临床分离株的毒力因子与耐药性分析

目的 检测临床分离肠球菌的耐药和毒力因子,比较粪肠球菌和屎肠球菌的耐药性和毒力特征.方法 采用琼脂稀释法检测肠球菌对万古霉素(VAN)、四环素(TET)、环丙沙星(CIP)、红霉素(ERY)、复方新诺明(SMZ)、替考拉宁(TEC)、克林霉素(CLI)的耐药性;采用微量板测定肠球菌的生物膜形成能力;观察肠球菌的β溶血和明胶溶解结果,同时用PCR方法检测相应基因cylA和gelE.结果 粪肠球菌和屎肠球菌的耐药率分别为0%～100%和3.23%～96.77%,后者对环丙氟哌酸、红霉素的耐药程度高于前者.β溶血试验阳性率为19.23%,cylA基因阳性率为35.38%;明胶表型阳性率为21.54%,gelE阳性率为40.0%,其中有46.15%(12/26)阳性者未出现相应表型;生物膜形成检出率为36.92%;粪肠球菌3种毒力因子(表型和基因型)的阳性率均高于屎肠球菌.结论 屎肠球菌耐药率高于粪肠球菌,粪肠球菌毒力因子阳性率高于屎肠球菌.     

临床分离粪肠球菌和屎肠球菌的耐药性监测

目的：了解粪肠球菌和屎肠球菌对抗菌药物的耐药性,为临床提供治疗依据。方法：对住院及门诊病人送检样本中培养分离出316株肠球菌(粪肠球菌126株,屎肠球菌190株)的感染分布与耐药情况进行分析。采用稀释法进行药物敏感试验,结果按美国临床实验室标准化研究所标准判定。结果：屎肠球菌对青霉素G的耐药率最高(93.7%),其次为红霉素、氨苄西林和环丙沙星。粪肠球菌对奎奴普丁/达福普汀耐药率最高为(74%),其次为四环素、红霉素和环丙沙星。粪肠球菌和屎肠球菌对利奈唑胺和万古霉素的耐药率均低于(2%),替考拉宁的耐药率最低均为(0)。结论：粪肠球菌和屎肠球菌对不同抗菌药物的耐药率有较大差异,在抗感染治疗前应先做细菌培养和药物敏感试验,依据报告结果合理选用抗菌药物。     

正常人肠道肠球菌esp基因与生物膜形成关系的初探

目的 了解正常人肠道肠球菌生物膜形成情况,探讨肠球菌esp基因与生物膜形成的关系.方法 用PCR法检测肠球菌esp基因,用96孔聚苯乙烯板进行生物膜形成试验.结果 84株正常人肠道肠球菌esp基因的检出率为14.3%,生物膜形成阳性率为25.0%,其中esp基因阳性株的生物膜形成率为83.3%,esp基因阴性株的生物膜形成率仅为15.3%.结论 正常人肠道肠球菌形成生物膜的能力较弱,esp基因是肠球菌形成生物膜的重要因素,生物膜的形成不局限于esp阳性菌株.     

如何快速鉴定临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌

目的建立荧光原位杂交法,快速鉴定临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌。方法将荧光同位素标记的粪肠球菌或屎肠球菌的核糖体16SrRNA及23SrRNA序列互补的寡核苷酸探针,在同一张玻片上杂交30min～1h,用杂交缓冲液洗涤10min,干燥后置显微镜下观察。结果探针的特异性金标准菌株证实,对163例临床标本测试结果与培养法结果比较,2种探针的特异性和敏感性均为100%。结论荧光原位杂交法适宜于临床标本中粪肠球菌和屎肠球菌的快速鉴定。     

777株临床分离肠球菌的分布及耐药性分析

目的了解本院临床肠球菌的菌群分布及耐药情况。方法采用回顾性调查分析方法对我院分离自各类临床标本的777株肠球菌进行统计,并对抗菌药敏试验结果进行分析。结果肠球菌菌株来源以尿液(30.5%)、胆汁(25.5%)、分泌物(17.8%)为主;2007～2010年分离的肠球菌对抗生素的耐药率有逐年增高趋势(P<0.05);屎肠球菌对多种抗生素的耐药率明显高于粪肠球菌,且在分离的肠球菌构成比有增高趋势。结论屎肠球菌在临床分离的肠球菌中越来越常见,肠球菌的多重耐药严重。     

2011—2015年临床分离粪肠球菌和屎肠球菌分布情况及耐药性分析

目的：了解徐州医科大学附属医院2011—2015年粪肠球菌和屎肠球菌的标本来源、科室分布情况及5年间的耐药性变迁。方法：应用梅里埃VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统进行细菌鉴定及抗菌药物敏感试验（MIC法）,结果按美国临床实验室标准化研究所标准（2014版）判定,以WHONET5.6软件分析数据。结果：2011—2015年共分离到999株非重复肠球菌属细菌,以粪肠球菌(494株)和屎肠球菌(386株)为主;菌株来源以尿液最多;粪肠球菌和屎肠球菌在重症医学科明显高于其他科室,其次为泌尿外科;屎肠球菌对一些常用抗菌药物的耐药率明显高于粪肠球菌。结论：本院重症医学科、泌尿外科和急诊ICU是预防控制的重点科室;5年间本院粪肠球菌和屎肠球菌耐药率明显高于CHINET水平,耐药形势严峻,需高度警惕,加强耐药监测和规范临床对抗菌药物的使用。     

屎肠球菌类透明质酸酶基因突变株的构建及功能研究

目的构建屎肠球菌类透明质酸酶基因（hyl）突变株,研究hyl基因的功能。方法用自杀质粒pTx4577通过体内同源重组,筛选获得hyl基因的突变株,研究体外hyl基因缺失对突变株生长能力的影响。通过小鼠腹膜炎和兔心内膜炎模型研究体内突变株的毒力情况。结果经同源重组,利用卡那霉素抗性筛选,PCR、脉冲场电泳和Southern印迹进行鉴定获得hyl基因突变株＋hyl,突变株在体外的生长能力低于野生株。小鼠腹膜炎模型中,在相同细菌感染浓度（3．7×10^9CFU／m1）下,野生株TX2466组小鼠在100h内的存活率为0,而＊hyl组小鼠的存活率为50％,差异有统计学意义（P〈0．01）。兔心内膜炎模型中,TX2466组主动脉瓣和壁性赘生物的菌落计数分别为（3．04±0．63）×10^6CFU／g和（6．87±0．58）×10^6CFU／g,而＊hyl组则分别为（0．21±0．06）×10^6CFU／g和（0．66±0．05）×10^6CFU／g,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论hyl基因突变株构建成功,hyl基因在屎肠球菌致病中起着重要的作用,可能是屎肠球菌的毒力因子之一。     

Nosocomial spread of hospital-adapted CC17 vancomycin- resistant Enterococcus faecium in a tertiary-care hospital of Beijing, China

Background  The incidence of vancomycin-resistant enterococci (VRE) appeared to be increasing in China, but very few nosocomial outbreaks have been reported. Our hospital had experienced an outbreak of VRE since March 2008 to March 2009. The objective of this study was to analyze the molecular features of the isolates and the control measures used to eradicate a VRE outbreak in a tertiary institution in China.

Methods  We characterized VRE isolates from 21 infected and 11 colonized inpatients from a single hospital by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), the analysis of Tn1546-like elements and virulence genes detection. Infection control measures, including more environmental disinfection, screening for VRE colonization, contact precautions, education and strict antibiotic restriction, were implemented to control the outbreak.

Results  During the outbreak, a total of 32 VRE strains were obtained. There were 21 strains found in Emergency Intensive Care Unit (EICU), 9 isolates from Geriatric Ward, and two from other units. All the isolates harbored the vanA gene, however, four of them exhibited the VanB phenotype. Meanwhile, MLST analysis revealed that all isolates belonged to clonal complex (CC) 17. With the infection-control measures, the epidemic was constrained in two units (EICU and Geriatric Ward). After March 2009, no further case infected with VRE was detected in the following one-year period.

Conclusion  The outbreak was controlled by continuous implementation of the infection control programme, and more rigorous infection control policy is needed.

     

53株临床分离肠球菌的耐药性及相关耐药基因分析

目的 了解临床分离的53株肠球菌的耐药性与耐药基因的存在状况.方法 采用VITEK-2全自动细菌鉴定仪检测肠球菌对9种抗生素的药敏结果,对该细菌进行总DNA的提取,用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因,结合药物敏感试验分析菌株的耐药特征.结果 53株肠球菌检出含红霉素耐药基因ermB 26株,占49.0％；含毒力因子mefA9株,占17.0％;含Tn1546/Tn916转座子19株,占35.8％；含Tn917转座子11株,占20.8％.53株肠球菌对红霉素耐药高达94.3％,对高水平庆大霉素、高水平链霉素、环丙沙星、四环素和氨苄西林的耐药分别为75.5％、73.6％、75.5％、66.0％、62.3％;对万古霉素和利奈唑胺敏感均高达98.1％.结论 耐药基因与肠球菌耐药性密切相关,随着医学环境的改变,肠球菌对抗生素耐药性正逐步上升.     

Extensive contact tracing and screening to control the spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium ST414 in Hong Kong

Background  Proactive infection control management is crucial in preventing the introduction of multiple drug resistant organisms in the healthcare setting. In Hong Kong, where vancomycin-resistant enterococci (VRE) endemicity is not yet established, contact tracing and screening, together with other infection control measures are essential in limiting intra- and inter-hospital transmission. The objective of this study was to illustrate the control measures used to eradicate a VRE outbreak in a hospital network in Hong Kong.

Methods  We described an outbreak of VRE in a healthcare region in Hong Kong, involving a University affiliated hospital and a convalescent hospital of 1600 and 550 beds respectively. Computer-assisted analysis was utilized to facilitate contact tracing, followed by VRE screening using chromogenic agar. Multi-locus sequence typing (MLST) was performed to assess the clonality of the VRE strains isolated. A case-control study was conducted to identify the risk factors for nosocomial acquisition of VRE.

Results  Between November 26 and December 17, 2011, 11 patients (1 exogenous case and 10 secondary cases) in two hospitals with VRE colonization were detected during our outbreak investigation and screening for 361 contact patients, resulting in a clinical attack rate of 2.8% (10/361). There were 8 males and 3 females with a median age of 78 years (range, 40–87 years). MLST confirmed sequence type ST414 in all isolates. Case-control analysis demonstrated that VRE positive cases had a significantly longer cumulative length of stay (P <0.001), a higher proportion with chronic cerebral and cardiopulmonary conditions (P=0.001), underlying malignancies (P <0.001), and presence of urinary catheter (P <0.001), wound or ulcer (P <0.001), and a greater proportion of these patients were receiving β-lactam/ β-lactamase inhibitors (P=0.009), carbapenem group (P <0.001), fluoroquinolones (P=0.003), or vancomycin (P=0.001) when compared with the controls.

Conclusion  Extensive contact tracing and screening with a “search-and-confine” strategy was a successful tool for outbreak control in our healthcare region.  

     

氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响

目的：探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜（BF）密度感应（QS）系统所调控的毒力因子编码基因以及各自对应毒力因子表达的影响．方法：通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的BF体外模型．采用不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR（rRT—PCR）检测其对Qs系统各毒力因子编码基因表达的影响;采用ELISA法检测外毒素A和弹性蛋白酶水平;采用地衣酚-硫酸法检测鼠李糖脂水平;采用Folin——酚比色法检测碱性蛋白酶活性．结果：经氨溴索3．750g／L作用后基因taxA,rtlA,lasB,aprA mRNA相对于培养基对照组的表达量均显著减少,由1．000分别变化为（3．03±0．08）,（2．70±0．09）,（2．10±0．10）,（2．20±0．10）（P〈0．05）．同时毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶的表达量也较培养基对照组明显减少,分别由（15220．16±988．89）,（81．38±5．44）,（289．73±6．72）,（5011±108．78）减少至（3481．59±599．64）,（29．76±3．84）,（101．74±3．32）,（1757±57．21）（P〈0．05）．经氨溴索1．875g／L干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显（P〈0．05）．结论：氨溴索可以降低BFQS系统调控的毒力因子编码基因以及各自对应的毒力因子的表达．     

枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊对肝硬化患者肠道屏障功能及肝功能的影响

目的探讨枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊对肝硬化失代偿期患者肠道屏障功能及肝功能状态的影响,为肝硬化患者肠道屏障功能的维护提供实验依据。方法将40例肝硬化患者随机分为对照组和观察组各20例,对照组给予常规保肝、利尿、降门静脉压力治疗和一般对症支持处理;观察组在对照组治疗基础上加用枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊治疗。在治疗前后分别测定血清内毒素及尿液乳果糖/甘露醇排出比(L/M),同时测定血清白蛋白(ALB)、天门冬氨酸转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平,并以Child-pugh分级进行评分。结果治疗前,观察组和对照组的血清内毒素水平、尿液L/M比值及血清ALB、AST和TBIL水平、Child-pugh评分差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后,观察组和对照组的血清内毒素水平、尿液L/M比值、血清AST和TBIL水平均较治疗前降低,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后血清ALB水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,观察组的血清内毒素水平、尿液L/M比值、血清AST水平及Child-pugh评分均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);但2组的血清ALB和TBIL水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊联合常规治疗可有效保护肝硬化患者的肠道屏障功能,降低肠道通透性,对肝硬化患者肝功能的恢复有一定辅助作用。     

金黄色葡萄球菌临床分离株生物膜形成能力及其相关基因的检测

目的： 检测临床分离金黄色葡萄球菌（金葡菌）的生物膜形成能力及其相关基因。方法： 用半定量微量平板法检测临床分离的92株金葡菌生物膜形成能力,并通过扫描电镜观察生物膜形态,用PCR法来检测生物膜形成的相关基因ica和sarA。结果： 92株临床分离金葡菌菌株均可形成生物膜,PCR结果显示100%的分离株均含有sarA基因,78株（84.78%）含有ica基因。结论： 临床分离的金葡菌都具有形成生物膜的能力,生物膜形成的相关基因ica和sarA的携带率较高。     

粪肠球菌基因hyl1功能的实验研究

目的建立动物感染模型,检测粪肠球菌类透明质酸酶基因hyl1缺失后毒力的变化。方法用粪肠球菌建立小鼠腹膜炎模型和兔心内膜炎模型,然后比较标准株、等位基因缺陷突变株hyl1 mutant和hyl1 mutant回复突变株毒力的变化。结果用粪肠球菌成功建立小鼠腹膜炎模型和兔心内膜炎模型。在小鼠体内实验中,等位基因缺陷突变株hyl1 mutant的毒力比标准株下降了1/4,hyl1 mutant回复突变株的毒力与标准株相似;于感染后12h行外周血白细胞计数和腹腔液细胞因子TNF-α测定,hyl1 mutant组明显低于标准株组,hyl1 mutant回复突变组所测结果与标准株相似。在兔心内膜炎模型中,hyl1 mutant组对心脏的致病性和病理改变也没有标准株组严重。结论粪肠球菌类透明质酸酶基因hyl1可能在粪肠球菌的致病性中起到重要作用,是编码肠球菌毒力因子的基因之一。     

Identification of a New Peptide Deformylase Gene From Enterococcus faecium and Establishment of a New Screening Model Targeted on PDF for Novel Antibiotics

INTRODUCTION Vancomycin is the drug of the last resort for treating resistant Gram-positive bacterial infections, and the emergence of vancomycin-resistance Enterococci (VRE) presents a serious threat to public health[1]. Till now there has been no effect…