TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测外周血CK19 mRNA

目的:应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,建立定量检测CK19 mRNA的方法. 方法:采用RT-PCR从胃癌细胞中克隆CK19片段(230 bp),装入pMD 18-T Simple载体.纯化质粒,制备荧光定量PCR标准品.应用LightCycle荧光定量PCR仪检测标准品、30例正常人外周血和5例肿瘤组织CK19 mRNA. 结果:PCR扩增及测序均证实CK19 cDNA片段重组到pMD 18-T载体上,建立了稳定的检测CK19 mRNA的标准,即设定CT值在35个循环之内,检测结果低于100个拷贝数量级为阴性标本.结论:采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术检测外周血CK19 mRNA是一种稳定可靠的方法.     

Allglo探针与TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测猴免疫缺陷病毒的比较

目的比较Allglo 探针和TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测SIV 的灵敏度下限和重复性。方法把SIV 标准品进行梯 度稀释成6 个浓度,每个浓度同时提取12 个标本进行批内差异分析,每个标本提取12 次进行批间差异分析之后进行逆转录 并用TaqMan探针和Allglo 探针进行定量PCR检测。批内差异分析者每个标本同时进行逆转录和上机检测,批间差异分析 者分12 次进行逆转录和检测,对这两种探针的PCR结果利用ABI7300 定量PCR仪所携带的软件和相关的统计学方法进行 分析。结果TaqMan 探针和Allglo 探针法检测SIV 标准品的灵敏度下限均为50 copies/mL。重复性结果显示：批内结果差 异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为0.63%,最小变异系数为0.33%,TaqMan 探针法最大变异系数为1.33%,最小变异 系数为0.2%;批间结果差异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为1.77%,最小变异系数为0.95%,TaqMan探针法最大变异 系数为1.86%,最小变异系数为1.03%。结论在荧光定量RT-PCR 法检测猴免疫缺陷病毒中,Allglo 探针法可能优于 TaqMan探针法。     

人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立检测人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT）基因的荧光定量RT-PCR方法。方法：根据GenBank中人FHIT基因序列,在保守区设计合成一对特异引物,将PCR扩增得到的FHIT基因克隆至PMD18-T载体上,构建的重组质粒标准品倍比稀释后运用SYBR Green I染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果：FHIT基因的标准品稀释度在1×107～1×103copies/μl范围内具有良好的线性关系,Ct值线性范围为14.28～28.36,相关系数为0.998,融解曲线分析表明,产物为特异的单峰,Tm为92.3±0.1℃。结论：建立了人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR方法,为在mRNA水平对人FHIT的定量分析奠定了基础。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV/SHIV病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品RS的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达4.60×101copies/μL,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.066。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒RNA载量。     

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的 建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法 依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定最PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果 测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论 成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

实时荧光定量PCR鉴别检测单纯疱疹病毒方法的建立

目的:建立快捷、灵敏、特异的单纯疱疹病毒(HSV)的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测及分型方法。方法:选择HSV1和HSV2的糖蛋白B基因设计一对通用引物和对应的探针组建2个FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品制作标准曲线,进行重复性和敏感性试验,以其他种类的细菌、病毒、真菌进行特异性分析,并用于检测生殖器疱疹患者的HSV1和HSV2。结果:HSV1和HSV2两标准曲线的线性检测范围均为105到1011Copies/L,相关系数均大于0.99,其他种类的细菌、病毒、真菌均未出现特异性扩增;48例生殖器疱疹患者疱液中HSV1和HSV2的检出率分别为6.3%(3/48)和87.5%(42/48)。结论:实时FQ-PCR法鉴别检测HSV1和HSV2,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,有助于HSV感染的流行病学和病理机制的研究;生殖器疱疹患者以HSV2感染为主。     

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的：制备NIDD基因TaqMan探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR（FQ-PCR）,以进一步研究NIDD的表达情况。方法：采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区（CDS）片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果：RT—PCR法扩增出一特异产物与预期长度112bp相符,DNA序列测序的结果与C,eneBank提供的已知序列（AB098078）比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112bp完全相同,与NIDD基因100％同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0．99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10％。结论：采用RT．PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqMan探针。     

丙型肝炎病毒核酸的荧光定量检测及其临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV-RNA含量方法的临床应用价值。方法:在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,PCR扩增目的片段并构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的巢式RT-PCR进行定性分析。结果:138例样本在HCV抗体阳性患者中,肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(P<0.05),而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.91)。结论:RFQ-RT-PCR检测HCV-RNA含量比ELISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HCV在体内的复制情况。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒（Murine Norovirus,MNV）的检测。方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果 该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数R2＝0.9986,可以检测到10拷贝/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78?0-2 TCID50/mL的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。 结论 本研究建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标, 能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒I型(FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR方法,并对方法的线性、特异性、敏感性、及稳定性等进行测定。用建立的方法对48份猫临床样品进行检测。结果成功建立FHV-1实时荧光定量PCR方法;该方法的线性范围为(1×102~1×109)copies/μL,与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应,检测灵敏度可达到10 copies/μL。批内变异系数均小于5%。应用该方法从48份猫临床样本中检测出33份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的快速定量检测。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

I型鸭肝炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立快速诊断I型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法 根据NCBI下载的20个来自我国不同省份的的I型鸭肝炎病毒的基因序列,找出其保守序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果 该方法敏感性达20拷贝,比常规PCR敏感性高。其特异性强,对番鸭细小病毒(MDPV),鹅细小病毒(GPV),新城疫病毒(NDV)和禽流感(AIV),鸭减蛋综合征病毒(EDSV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),禽呼肠弧病毒(ARV)8种病毒的检测均为阴性,I型鸭肝炎病毒检测结果为阳性。用建立的方法检测了江苏徐州采集100份样品,阳性率为92%。说明I型鸭肝炎病毒在江苏徐州地区的鸭群中普遍存在。结论 建立了I型鸭肝炎病毒荧光定量PCR方法。     

定量实时RT-PCR检测非霍奇金淋巴瘤端粒结合因子2 mRNA的表达

目的:建立定量实时RT-PCR,研究非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者肿瘤组织端粒结合因子2(TRF2)mRNA表达.方法:用RT-PCR扩增目标基因cDNA,电泳后切胶、纯化作为标准品,建立待测基因标准曲线;用实时RT-PCR测定32例NHL和8例反应性淋巴结炎患者淋巴组织TRF2的表达.结果:实时RT-PCR标准曲线中,模板cDNA含量和扩增时产生的荧光信号相关系数为0.996.实时RT-PCR终点产物凝胶电泳的基因条带灰度值和模板cDNA含量的相关系数为0.779(P＜0.05).在NHL患者中,滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤TRF2 mRNA表达量分别为(22.943±9.424)amol、(23.181±5.983)amol和(18.339±7.910)amol,与良性反应性淋巴结炎组织[(21.796±4.800 )amol]相比无显著性差异(P>0.05).但Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量为(33.170±12.841)amol,显著高于良性反应性淋巴结炎组织和其他类型恶性淋巴瘤(P＜0.05).结论:定量实时RT-PCR能精确测定目标基因mRNA表达.在NHL中,Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量明显高于滤泡型淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤.     

TaqMan real-time fluorescent quantitative RT-PCR in detection of macrophage in-flammatory protein-2γ mRNA in myocarditis murine

Objective: To study the role of macrophage inflammatory protein (MIP)-2γ in myocarditis pathogenesis in BALB/c mice. Methods: The relationship, between the progression of Coxsarckie virus B3 ( CVB3 ) viral myocarditis and experimental autoimmune myocarditis and MIP-2γ mRNA expression in mouse was studied by TaqMan real-timefluorescent quantitative RT-PCR. Results: MIP-2γ mRNA expression rose on 3 to 5 d after CVB3 infection, reachedpeak on 7 d, and returned to normal level until 14 d, which corresponded well with the disease course. The MIP-2γ/mRNA expression level rose significantly on the day 18 d after immunization with porcine cardiac myosin, which wasconsistent with pathological examination. Conclusion: MIP-2γ/may be involved in the pathogenesis of myocarditis.     

实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究

目的应用实时荧光RT-PCR快速检测2009～2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据。方法采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型。结果以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28%。其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份。结论实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用。