结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的探讨耐异烟肼结核分支杆菌KatG基因突变在结核分支杆菌耐异烟肼耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应——单链构象多态性(PCR-SSCP)分析72株结核分支杆菌KatG基因突变。其中32株为异烟肼(INH)敏感株,40株为INH耐药株,用PCR-SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照。结果所有INH敏感株SSCP带谱与对照相同;40株INH耐药株中15株与对照相同,25株有不同程度的差异,INH耐药KatG基因突变或缺失的阳性率为62.5%。结论多数结核分支杆菌耐INH是由于其KatG基因突变所致,用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下：     

结核分支杆菌耐药的分子机制研究进展

目前结核病仍是威胁人类健康的3大感染性疾病之一,是仅次于艾滋病的第2大致死性感染性疾病。我国至今仍是结核病的高发国家,结核病的患患者数仅次于印度居于第2位。现在全国约有600万名结核病患者,每年约25万人死于结核病,结核病仍然是世界卫生组织和我国重点防治的重大传染性疾病之一。     

结核分支杆菌异烟肼和链霉素耐药基因的杂交检测

异烟肼（INH）、链霉素（SM）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视。传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6—8周时间，不能及时指导临床用药。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性。     

耐异烟肼结核分支杆菌分子生物学研究进展

近年来结核病再度流行,耐药结核菌株的出现是重要原因之一。异烟肼作为治疗结核病最主要的一线药物,其耐药率显著上升,我国异烟肼耐药率已达20％以上。结核分支杆菌对异烟肼的耐药机制较为复杂,涉及多个分子靶位,近年来在结核病研究中倍受关注,国内外已有这方面的研究报道。本文对近年来耐异烟肼结核分支杆菌的分子生物学研究进展作一综述。     

PCR-SSCP法检测耐多药结核分支杆菌耐药性

我国是结核病疫情最严重的国家之一，其主要原因是耐药和耐多药结核病的广泛分布和迅速传播。异烟肼（INH）和利福平（RFP）均是抗结核的一线药物，对于其作用机理及结核杆菌的耐药机制的研究日益受到重视。据报道认为结核分支杆菌耐与RNA聚合酶的8亚基的编码基因rpoB的突变有关；耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性。我们采用PCR—SSCP银染法直接检测临床分离株中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。     

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平（RFP）、异烟肼（硼）和链酶素（SM）结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatG、rpsL基因突变情况，评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）对373株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株148株，耐RFP、INH、SM株共225株）rpoB基因、KatG和砒基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90％、91％、90％、91％、90％、93％、91％；KatG基因突变率分别为69％、63％、71％、68％、67％、68％、65％，rpsL基因突变率71％、69％、74％、68％、70％、61％、76％，分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异（X^2=0．46，P＞0．05）。同时rpoB基因敏感株均无突变，特异性为100％；KatG基因有3株发生突变，特异性为98％。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TIE，1株526位密码子CAC→TAC，7株发生在516位密码子GAC→GTC，5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变率大致相同，rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP、INH和SM耐药性。     

结核分支杆菌临床分离株rpoB基因突变的研究

目的：了解我院结核分支杆菌耐RFP临床分离rpoB基因的突变特点。方法：利用PCR和测序试验,分析了50株结核分支杆菌临床分离株及H37Rv标准株的rpoB基因,包括核心区域的81个碱基在内的184bp的基因片段,结果：20株敏感株未发现rpoB基因的突变,30株耐药株中,28株（93.3%）出现rpoB基因的突变,突变位置集中在rpoB基因核心区域内的27个氨基酸内,531,526两个密码子的突变率为60.7%（17／28）,未发现缺失或插入突变。高浓度耐药（R250）突变位置主要在531位氨基酸,占52.4%（11／21）,低浓度耐药（R50）突变位置主要在526位氨基酸,占57.1%(4/7)。结论：rpoB基因核心序列的检测,可作为利福平耐药的指标,对临床用药有指导意义。     

快速检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性的临床应用

目的建立快速检测结核分支杆菌耐药基因的分子药敏方法。方法要聚合酶链反应——单链构象多态性（PCR—SSCP）分析40株结核分支杆菌KatG基因突变。其中20株为异烟肼（INH）敏感株,20株为INH耐药株,用PCR—SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照．结果所有INH敏感株SSCP带普与对照相同;19株INH耐药株中8株与对照相同,11株有不同程度的差异,INH耐存KatG基因突变或缺失的阴性率为60％。结论多数结核分支杆菌INH是由于其KatGj基因突变所致,用PCR—SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究

目的 应用多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析（multiple—Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation Polymorphism,multi—PCR—SSCP）方法,快速、特异地同时检出耐异烟肼（isoniazid,INH）结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况,并与直接测序（derictsequencing,DS）结果相比较,参照药敏试验,探讨该方法的可行性。 方法 根据结核分支杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用multi—PCR-SSCP技术,同时检测对结核分支杆菌耐INH起作用的这三个基因的突变情况;同时进行耐药株的测序分析。 结果 对H37Rv标准株、临床分离INH敏感株（23株）及INH耐药株（35株）进行multi—PCR—SSCP分析,突变检出率82．9％（29／35）;耐药株测序分析突变检出率为85．7（30／35）。两种方法的符合率为97．1％E（29＋5／）／35]。 结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,multi—PCR—SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG三个INH耐药基因的突变,提高检验效率,有望成为临床指导用药的好方法。     

PCR-SSCP 法检测结核分支杆菌耐药基因

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH、SM和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。国内外已有报道RFP、INH、SM耐药性的产生是由于rpoB基因、KatG基因和rrsP基因突变所致。而用PCR—SSCP方法直接检测临床标本则少有报道。我们采用PCR—SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpsL基因、rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。     

结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究

目的:探讨结核分支杆菌异烟肼(INH)表型耐药与KatG基因密码子315位和463位基因改变的相关性。方法:采用基因直接测序法对结核分支杆菌分离株KatG基因进行分析。结果:132株异烟肼耐药菌株中68株KatG基因密码子315位有基因突变,突变率51.52%(68/132),野生型密码子315AGC(Ser)突变成ACC(Thr)60株,AAC(Asn)6株,ACA(Thr)1株,GGC(GIy)1株。133株INH敏感菌株未发现KatG 315位基因突变。132株INH耐药菌株中123株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为93.18%,野生型密码子463CGG(Arg)突变成CTG(Leu)123株;133株敏感菌株中114株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为85.71%,野生型密码子463 CGG(Arg)突变成CTG(Leu)114株。结论:①KatG基因315位密码子突变是菌株异烟肼表型耐药的重要分子基础,以Ser315Thr错义突变为主。②KatG基因463位密码子突变与异烟肼耐药表型没有相关性,不是结核杆菌异烟肼耐药的分子标志。该位点突变可能是基因多态性,与结核菌治疗带来的选择性压力无关。     

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值。方法47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变。结果47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的 应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值.方法 47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变.结果 47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变.结论 PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测.     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析，对35例耐INH（或含耐异烟肼）、63例耐RFP（或含耐RFP）的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异。rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性。15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测

目的：探讨结核分支杆菌对链霉素(SM)的耐药分子机制,评估应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术检测rpsL基因突变在结核分支杆菌对SM耐药性测定中的应用价值。方法：采用PCR－SSCP方法对71株结核分支杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株,耐SM或含耐SM耐多药株36株）和30例耐SM肺结核病人痰标本的rpsL基因突变进行检测。结果：以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rpsL基因PCR扩增产物267bp片段SSCP图谱正常;36株耐SM分离株中,26株rpsL基因SSCP图谱异常,其突变率为72．2％。30例耐SM肺结核病人痰标本有22例PCR扩增阳性,14例SSCP图谱与H37RV株有差异,rpsL突变率为63．6％。结论：rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,PCR－SSCP技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rpsL基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测。     

结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因检测芯片的研究

目的建立用于检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的基因芯片，并与基因测序和常规药物敏感性试验进行比较，探讨其使用价值。方法根据结核分枝杆菌katG基因突变的规律，设计不同的探针，制备可检测katG基因突变的芯片，并且同时检测药物敏感株和耐药株的katG的变异情况。结果结核分枝杆菌临床分离株共137株，至少耐1种抗结核药物共97株（70．8％）。耐异烟肼的比例为32．8％（45／137）。敏感株katG基因扩增阳性率为100％。耐INH菌株katG的阳性率为88．9％（40／45）。PCR检测katG阳性率为91．1％（41／45）。耐INH菌株katG的缺失率为8．9％。katG315位密码子的突变依次为AAC（32．5％，13／40），ACC（15．0％，6／40），ACA（10．0％，4／40）。ATC（5．0％，2／40）和AGC（5．0％，2／40）。基因芯片检测、药物敏感性试验和基因测序的结果一致。结论本研究建立的检测结核菌katG基因突变的基因芯片技术敏感性高，特异性强，可用于结核菌的快速药物敏感性试验评价。     

340株痰结核分支杆菌耐药结果分析

目的探讨340例肺结核病人痰培养阳性菌株对常规抗结核药物的耐药性。并对耐INH、RFP、SM及耐HR者进行敏感药物的选择。方法应用Baetec或改良罗氏法，采用绝对浓度法进行结核分支杆菌药物耐受性测定。结果耐药顺位次序为RFP45．9％、SM45．3％、INH34．4％、EMB18．6％、PAST．4％、HR23．8％。结论我市属于高耐药区域．以耐RFP、SM、INH居前三位，耐HR率亦很高。DIP、OFLX、PCM对耐HR菌株敏感。     

TDI-FP技术检测耐乙胺丁醇结核分支杆菌embB306点突变

目的 应用TDI-FP技术分析结核分支杆菌embB 306点突变与乙胺丁醇耐药性的关系，并建立一种准确、快速的诊断结核分支杆菌乙胺丁醇耐药的新方法。方法 对临床82例耐多药结核病患者所感染的结核分支杆菌菌株进行常规培养和药敏实验；提取结核分支杆菌DNA，并PCR扩增205bp的embB基因片段，消化降解掉PCR产物中残余的dNTPs和引物，进行模板指导的荧光标记终止碱基掺入反应；应用Victor2测定反应产物的荧光偏振值，分析所有样品的embB基因306位点的基因型；对分析结果进行测序验证。结果 5例乙胺丁醇高度耐药患者中有3例所感染的结核分支杆菌发生embB 306的ATG→GTG突变；47例乙胺丁醇低度耐药患者中有15例为embB 306突变和未突变的混合感染；30例乙胺丁醇敏感患者的结核分支杆菌未发现embB 306突变。测序结果与实验相符合。结论 embB 306突变与结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性密切有关；应用TDI-FP技术可以准确、快速简便检测embB 306突变，在结核分支杆菌耐乙胺丁醇的临床诊断中具有潜在的应用前景。     

1011株结核分支杆菌耐药趋势研究

目的探讨本市结核分支杆菌的耐药趋势。方法根据世界卫生组织(WHO)耐药指南要求,使用WHO推荐的比例法,对本院2005～2008年的经鉴定为结核分支杆菌的菌株做异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福科(RFP)、乙胺丁醇(EMB)4种药物的药敏试验。结果共入选涂阳患者1062例,其中培养阳性1012例(非结核分支杆菌1例),耐药菌株564例,总耐药率55.8%,初始耐药率为49.5%,耐多药率为21.0%。获得性耐药率为69.3%,耐多药率为38.1%。结论本市结核病控制工作任务艰巨,耐药和耐多药情况需要密切关注。