链霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

利用直接化学交联法将链霉素(SM)与蛋白载体(BSA,OVA)偶联生成免疫原和包被原,对偶联产物采用紫外扫描和麦芽酚试验鉴定偶联成功。用免疫原免疫BALB/C小鼠,用间接ELISA检测抗体效价,采用竞争ELISA测IC50,获得了效价为1:51200,IC50为23.62ng/ml的链霉素多克隆抗体,与双氢链霉素的交叉反应率为107%,与同类的其它药物均无交叉反应。     

雌二醇多克隆抗体的制备与鉴定

制备雌二醇完全抗原,并通过免疫家兔得到多克隆抗体,为下一步制备雌二醇单克隆抗体和雌二醇检测ELISA试剂盒奠定基础。试验以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用碳化二亚胺法,合成了雌二醇(E2)的2种免疫偶合物:免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联成功与否,并对偶合物的蛋白含量、结合比进行测定并以免疫原E2-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,用包被原E2-OVA进行ELISA,对多克隆抗体特异性及效价进行检测。结果表明成功合成了雌二醇人工抗原即免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA,二者的蛋白浓度分别为5.455和7.533mg/mL,结合比分别为7:1和8:1;制备的多克隆抗体特异性好,血清效价为1:106。     

盐酸克伦特罗人工抗原及抗体的制备

为了制备盐酸克伦特罗(CL)人工抗原及抗体,试验采用重氮化法将盐酸克伦特罗与经过活化的牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫抗原(CL-BSA)和检测抗原(CLOVA),经紫外光谱扫描对偶联物进行鉴定;用免疫抗原免疫BALB/c小鼠制备盐酸克伦特罗多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价。结果表明:盐酸克伦特罗人工抗原合成成功,制备的鼠源多克隆抗体效价达1∶64 000,该抗体可用于下一步试验。     

赭曲霉毒素A完全抗原的制备及鉴定

赭曲霉毒素A(OTA)是一种对人和动物具有广泛毒性的霉菌毒素,为建立OTA在食品和饲料中的快速检测方法,采用活性酯法(NHS)将OTA与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,分别制备了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE鉴定表明,OTA与BSA和OTA与OVA偶联成功,偶联物OTA-BSA和OTA-OVA的偶联比分别为7∶1和4.5∶1。用免疫原OTABSA免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,用OTA-OVA包被ELISA板进行检测,小鼠血清中抗OTA的抗体效价最高可达1∶51 200。表明制备的免疫原OTA-BSA具有良好的免疫原性,为OTA单克隆抗体的制备奠定了基础。     

莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定

用戊二酸酐将盐酸莱克多巴胺活化成莱克多巴胺-戊二酸酐半醛,用混合酸酐法将莱克多巴胺-戊二酸酐半醛与KLH和BSA偶联,合成免疫原和包被抗原,经核磁共振法和紫外吸收法鉴定,偶联成功.用紫外吸收法测定免疫原和包被抗原的偶联比分别为24：1和2.5：1.用免疫原免疫新西兰白兔,采用间接ELISA法检测抗体效价,采用间接竞争ELISA法检测IC50值,获得了效价为1：6 000以上、IC50值为10 ng/mL的多克隆抗体,证明合成的人工免疫原具有免疫原性.     

恩诺沙星完全抗原的合成及兔源多抗血清的制备

为了合成恩诺沙星（enrofloxacin,EFLX）完全抗原,制备兔源多克隆抗体血清,试验通过活化酯法将小分子的EFLX偶联到牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白(OVA)上,形成偶联物EFLX-BSA和EFLX-OVA,以EFLX-BSA为免疫原免疫兔,以EFLX-OVA为检测原通过ELISA方法检测兔血清效价。结果表明,免疫兔血清效价都在1∶51200以上,其中2号兔效价最高,达到1∶204800,敏感性好,半数抑制浓度IC₅₀为169.91 ng/mL,检测范围为37.52～302.31 ng/mL。本试验成功制备了EFLX完全抗原,获得了敏感的兔源多克隆抗体血清,为以后ELISA试剂盒和胶体金试纸条的研发奠定了基础。     

苯乙醇胺A人工抗原的合成及鉴定

采用重氮化法将苯乙醇胺A分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原苯乙醇胺A(PEAA)-BSA和检测抗原PEAA-OVA。经紫外扫描法和SDS-PAGE鉴定表明偶联成功,偶联比分别为15∶1、17.4∶1。用PEAA-BSA免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法检测抗体效价,采用竞争ELISA法检测IC50值,获得了效价4.1×105以上、IC50值为0.2μg/L的多抗血清,证明合成了具有免疫原性的人工免疫原。     

氯霉素人工抗原的合成及其抗体的制备

为了合成氯霉素(CAP)人工抗原并制备抗体,试验建立CAP残留的酶联免疫吸附试验(ELISA)法,采用重氮化法将半抗原CAP与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制得免疫抗原,然后与卵清白蛋白(OVA)进行偶联,制得包被抗原,通过紫外光谱扫描鉴定是否偶联成功;用免疫抗原免疫KM小鼠,制备CAP多克隆抗体,并通过间接ELISA法测定抗体效价。结果表明:通过紫外光谱扫描,CAP-BSA在275 nm处为最大吸收峰,CAP-OVA在276 nm处为最大吸收峰;并且免疫KM小鼠得到的抗体效价高达1∶128 000。说明试验成功制备了CAP人工抗原,并且获得了高效价的多克隆抗体,也进一步证明了药物偶联成功。     

酸性红73人工抗原的合成与鉴定

为进一步制备酸性红73新型人工抗原,试验采用N,N-羰基二咪唑(CDI)法合成酸性红73的免疫原和包被原,经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定偶联成功,酸性红73与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)的偶联比分别为9∶1和5∶1。免疫后所得兔源多克隆抗体,采取双向琼脂扩散实验和方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度分别为1∶4000、1∶8000。     

三聚氰胺抗原合成及其多克隆抗体的制备

以2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪为原料,强碱条件下与3-巯基丙酸反应,制备三聚氰胺半抗原并经质谱和红外鉴定;应用碳二亚胺法将半抗原与BSA和OVA偶联制备三聚氰胺免疫原和包被原,完全抗原经紫外扫描鉴定偶联成功,偶联比分别为16:1和10:1,通过免疫新西兰大白兔成功制备三聚氰胺多克隆抗体,抗体效价可达1:128000以上。本研究为三聚氰胺人工抗原的制备提供了有效途径,为三聚氰胺免疫检测方法的研发奠定了基础。     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

大观霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

Using spectinomycin (SPE), carboxyl methyl hydroxylamine hydrochloride （CMO）， glycol diglycidyl ether （EDE）, bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin （OVA） as the main stuff, four artificial-immunogens had been obtained by the N-hydroxysuccinimide-activated ester method and the EDE double functional group method. Ten female rabbits were immunized with this two artificial-immunogens. Animal immune test demonstrated that there were antibodies against SPE in rabbits sera. The polyclonal antibody was measured with indirect ELISA test. The titer was 1∶160000 and the IC₅₀ was 0.484 ng/mL. This study laid the basis for further research on the immune test kit for the SPE remnant.     

SMD单克隆抗体的制备及测定方法的建立

用戊二醛作为偶联剂 ,将磺胺对甲氧嘧啶 (SMD )与牛血清白蛋白 (BSA )或卵清蛋白 (OVA)偶联形成完全抗原 ,经紫外分光光度计扫描鉴定。以人工抗原免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与骨髓瘤细胞 (SP2 /0 -Ag1 4)融合 ,用间接ELISA联合竞争ELISA法筛选出产生针对SMD抗体的杂交瘤细胞。经克隆 ,得到 3株特异性好的阳性杂交瘤细胞 ,注入小鼠腹腔产生腹水。建立了测定SMD的ELISA法 ,其检测下限小于5ng/mL。     

饲料添加剂碱式氯化锌合成新工艺探索及研究

该试验采用氨氯化铵浸出法浸取次氧化锌,制备饲料添加剂碱式氯化锌(ZnCl₂·4Zn(OH)₂·H₂O)。研究结果表明,在浸出条件为氨与铵根摩尔比为1∶1、总氮与锌摩尔比为10∶1、温度为313 K、时间为60 min时,Zn的浸出率达90%以上。同时,对合成产品进行了主含量、XRD、SEM分析,结果显示产品各项指标均符合GB/T 22546-2008要求。试验还表明该工艺具有方法新颖、流程简单、成本低、安全、高效、环保等特点,从根本上实现了废物资源化的利用,同时还可以生产出质量合格、稳定的新型饲料添加剂碱式氯化锌。     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR<0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R^2=0.990),其IC₅₀为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

SMD残留检测的ELISA方法的建立和初步应用

用戊二醛法将SMD与载体蛋白BSA偶联 ,制备合成抗原SMD BSA作免疫原 ,同法合成包被抗原SMD OVA ,免疫健康家兔获得抗血清。分别用双向琼脂扩散试验和ELISA试验对抗血清进行定性定量测定 ,结果表明所获抗血清特异性针对SMD。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件 ,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度 (50 μg/mL) ,抗血清最佳稀释度 (1∶1 0 0 ) ,酶标抗体的最适工作稀释度 (1∶50 0 ) ,并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在 1 0～ 2 0 0 0 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系。该法检测底限为 63μg/L,低于国际规定残留限量 (1 0 0 μg/kg)和国内规定残留限量 (30 0 μg/kg)的要求。本法同时测定了回收率以及实际样品血清中的SMD的残留含量     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

将多西环素（doxycycline,DOX）进行化学修饰引入羧基或氨基等活性基团,然后与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA和包被原DOX—PABA—OVA、DOX～OVA,并用紫外吸收（UV）、凝胶电泳（SDS—PAGE）和EUSA方法对人工抗原进行鉴定;将合成的人工抗原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA分别免疫BALB／C小鼠,用间接ELISA方法测定多抗（pAb）效价,用竞争ELISA方法鉴定其敏感性,用交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,二个免疫组6只小鼠血清抗体效价均在1：6400以上,DOXpAb对DOX的50％抑制浓度（IC50）在39．79～53．13μg/L,抗血清与四环素类药物交叉反应很低。本实验为建立多西环素ELISA残留免疫学检测方法和并制备多西环素试剂盒奠定了基础。     

达氟沙星间接竞争ELISA检测方法的建立

将达氟沙星（danofloxacin, DFLX）与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联分别作为免疫原与包被原, 达氟沙星为竞争的半抗原，建立间接竞争ELISA检测方法。试验结果表明,理想的包被抗原浓度为1.25 μg/L, 多抗(DFLX-PcAb)工作浓度为1∶10000,酶标二抗的工作浓度为1∶4000,最适检测范围为0.1～10 ng/L,最低检测限为0.2 ng/L, 批内和批间变异系数分别为3.81%和6.25%。得到回归方程y=0.7975-0.125x（R2=0.989）和标准曲线，从而建立了DFLX的快速检测残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）。     

石房蛤毒素单克隆抗体的制备及其特性研究

将石房蛤毒素（Saxitoxin,STX）与牛血清白蛋白(BSA)偶联构建完全抗原STX-BSA,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗STX单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类为IgM。体内诱生法收集腹水单抗,间接ELISA方法测定抗体效价为1∶102400,抗体亲和常数为3.71×106 L/mol。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。