自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究

目的 重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的临床诊断和病情监测。方法 针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a（＋）,构建重组表达载体PET28a（＋）-gp210,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2＋亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a（＋）-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异（P〈0.05）。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论 应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。     

核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探

目的克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因，构建重组表达质粒，获得具免疫学活性的纯化重组蛋白，建立酶联免疫吸附法（ELISA），初探抗核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗体在原发性胆汁性肝硬化（PBC）诊断中的意义。方法构建重组表达载体，在大肠杆菌BL21、M15中表达；融合蛋白经Ni—NAT树脂柱进行亲和层析纯化，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹法（WB）进行免疫活性鉴定；应用表达蛋白建立间接ELISA，检测60名健康体检者、68例原发性胆汁性肝硬化（PBC）、60例病毒性肝炎、60例结缔组织病患者血清中抗gp210、p62和LBR抗体。结果经重组质粒测序和酶切结果证实，gp210、p62和LBR目的基因已正确插入原核表达载体中，基因序列正确，符合表达框架；SDS-PAGE检测表达产物分别在69000、62000和27000处有一明显的蛋白表达条带，WB分析表明重组蛋白具有人gp210、p62和LBR抗原反应性。ELISA检测标本血清结果显示，PBC中，抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体阳性率分别为36．8％、30．9％和5．9％；而病毒性肝炎组、结缔组织病组和健康体检组中，除抗gp210抗体在结缔组织病患者中阳性率为1．7％外，3种自身抗体检测结果均为阴性。PBC组3种自身抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05和P〈0．01）。结论本研究成功克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因，并将其在大肠杆菌中成功表达。应用纯化融合蛋白建立的ELISA检测抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体，对PBC具有较好特异性，为PBC的特异性临床诊断提供了有效的工具。     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定

目的构建抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,在大肠杆菌里表达,并鉴定及纯化。方法采用PCR的方法,扩增融合基因DAB389-Linker-CD133(scFV),并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a-DAB389-CD133,融合蛋白在BL21(DE3)中表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,通过Ni柱纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的DAB389-Linker--CD133(scFV)融合蛋白。Western blot鉴定蛋白活性。流式细胞仪检测能否与CD133抗原特异性结合。结果扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;纯化得到纯度为95%的重组蛋白。Western blot分析能特异性地与抗白喉抗体结合。流式细胞仪检测能与CD133抗原特异性结合。结论成功构建了抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,具有结合抗原和免疫毒素双重活性,为进一步靶向治疗奠定了基础。     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

人可溶性生长刺激表达基因2蛋白的真核表达、纯化和鉴定

目的构建人可溶性生长刺激表达基因2(sST2)蛋白的重组真核表达载体,获得高纯度的人sST2重组蛋白。方法根据人sST2基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得人sST2基因;构建人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体;脂质体法转染COS7细胞,表达人sST2重组蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化;用western blot和ELISA法对人sST2重组蛋白进行鉴定。结果PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示产物长度与预期一致,约为1000 bp;同源性比对分析结果显示,人sST2基因成功插入PGH-T载体;用Bam HⅠ和Hin dⅢ对重组真核表达载体双酶切后凝胶电泳分析,结果显示产物电泳位置与预期一致;表达产物经SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量(M r)约为65000处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致;western blot鉴定结果显示人sST2重组蛋白有His标签,ELISA鉴定结果显示人sST2重组蛋白有与抗sST2抗体结合的特异性抗原表位。结论通过重组DNA技术成功构建人sST2基因重组真核表达载体,通过蛋白质纯化技术成功获得人sST2重组蛋白。     

α-SEA型地中海贫血标志蛋白zeta链蛋白的克隆表达与鉴定

目的克隆zeta链蛋白基因并在大肠杆菌中表达,经纯化与鉴定,为建立α-SEA型地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从经处理的K562细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术反转录并将其克隆到pET-21a( )载体中,测序验证。融合蛋白在大肠杆菌中表达,采用Probond树脂柱纯化融合蛋白,用WesternBlotting和ELISA鉴定。结果成功构建了融合表达载体pET-zeta,融合蛋白得到可溶性表达及纯化,经Westernblotting和商品ELISA试剂盒鉴定显示重组蛋白为zeta链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化zeta链蛋白,为地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗GST-IRS4多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。     

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性.方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中.0.5 mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠.ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性.结果:SDS-PAGE示在约87 kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51 200.Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别.结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性.     

HTLV-I gp21外膜蛋白基因片段的克隆和融合表达

目的　克隆HTLV 1 gp2 1外膜蛋白基因片段并在 pGEX 2T载体中融合表达。 方法　人工合成 4条寡核苷酸片段 ,串联成HTLV Igp2 1外膜蛋白基因片段 ,然后克隆入T载体 ,进行序列分析 ;再将序列正确的HTLV Igp2 1外膜蛋白基因片段亚克隆入pGEX 2T融合表达载体中 ,进行融合表达 ,并对表达的融合蛋白进行鉴定。 结果　序列分析结果显示 :利用人工合成的寡核苷酸片段串联成HTLV Igp2 1外膜蛋白基因片段是可行的 ;HTLV Igp2 1外膜蛋白基因片段亚克隆入pGEX 2T融合表达载体中得到了融合表达 ,且具有抗原性。 结论　具有特异抗原性的HTLV Igp2 1融合蛋白的成功表达为HTLV诊断试剂盒的研制奠定了基础 ,对保障输血安全具有意义。     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性.     

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的 为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原.方法 根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1 外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41.诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析.结果 gp41在大肠埃希菌BL21 (DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%.纯化后截短体gp41的纯度为97.94%.经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性.结论 研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值.     

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异眭．本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白DD65的嵌台抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333，f1)及pp65(氨基酸261～373，f2)两个片段．以不同酶切位点插人到pTrcHi B载体上，筛选正确的重组质粒并在太肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDE-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％，卧包涵体的形式存在，分子量为35000。以金属鳌合亲和屡析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白，纯度达到96％，回收率为252％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清，敏感性达到904％(19／21)，证明此融合蛋白具有良好的抗原性，可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。     

自身抗原OGDC-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的 基因工程重组表达2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）融合蛋白。方法 用PCR方法扩增得到OGDC-E2的基因片段，插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-OGDC-E2，测序正确后在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。结果 获得OGDC-E2融合蛋白，经SDS-PAGE分析，相对分子质量与预期大小一致；经免疫学鉴定，重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性。结论 基因重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验诊断。     

重组泡球蚴主要表面抗原在棘球蚴病免疫诊断中的效果

目的 研究非融合表达重组抗原用于棘球蚴病免疫诊断的效果。方法 将泡球蚴主要表面抗原基因编码序列克隆于原核非融合表达载体pQE30（＋）并进行表达。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及免疫印迹（WB）试验对重组抗原鉴定。亲和层析纯化重组抗原，用于酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清特异性抗体。结果 SDS—PAGE及WB分析显示泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌内得到了高效非融合表达。以此重组抗原进行ELISA试验，检测棘球蚴病68例，阳性率达97．1％，检测囊虫等其他感染性疾病80例及健康人血清20份，阴性符合率达98％。结论 泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌中获得了高效非融合表达，以该重组抗原建立的ELISA试验，对棘球蚴病诊断具有较高的敏感性和属特异性。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

截短的丙型肝炎病毒核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因在Sf9细胞中的融合表达

目的构建含截短的HCV核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,探讨其在Sf9细胞中的表达和抗原性。方法用PCR法扩增截短的HCV核心蛋白基因片段(Ct)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将其插入转座子载体pFastBac1,构建成重组表达载体pFastCt-EGFP,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒穿梭质粒BacmidCt-EGFP,转染昆虫Sf 9细胞。结果SDS-PAGE和western blot鉴定表明成功表达了分子量约40 000的融合蛋白。以ELISA法检测发现该融合蛋白能与28份抗HCV抗体阳性血清中的15份发生反应,阳性率为53.6%。结论该融合蛋白在昆虫Sf 9细胞中成功表达并具有一定的抗原性。