氟伐他汀对C反应蛋白诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞见黏附分子-1的影响

目的探讨氟伐他汀对C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响。方法进行HUVECs原代培养,取第3~6代进行实验。分别以5、10、50和100mg/L浓度CRP作用HUVECs,分别作用6、12和24h,同时用氟伐他汀10-8、10-7、10-6和10-5mol/L浓度进行干预。用ELISA法测ICAM-1蛋白含量,RT-PCR测ICAM-1 mRNA表达。结果HUVECs对照组有少量ICAM-1蛋白和mRNA表达;CRP组ICAM-1蛋白和mRNA表达明显增强(P<0.01),且ICAM-1蛋白表达呈浓度和时间依赖性增加(P<0.01);氟伐他汀组ICAM-1蛋白及mRNA表达明显减弱(P<0.01),且氟伐他汀抑制CRP诱导的ICAM-1蛋白表达呈浓度依赖性(P<0.05)。结论氟伐他汀可能通过抑制CRP诱导ICAM-1产生,发挥抗动脉粥样硬化形成的作用。     

湍流流动对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

本研究考察了ECs在不同流场中的血管细胞黏附分子(VCAM-1)和胞间黏附分子(ICAM—1)表达，揭示了湍流流体力学信号影响黏附分子表达和ECs功能状态。构建了层流和湍流的离体流室模型，运用共聚焦显微镜，从蛋白水平考察培养的人脐静脉ECs中VCAM-1和ICAM-1在不同流室中的表达。发现层流中VCAM-1表达显著增强，而ICAM-1表达只一过性增加，随即回落。湍流中VCAM-1表达下降，而ICAM-1表达持续缓慢上升。由此表明：湍流流场对血管ECs黏附特性的影响不同于层流，而且不同的黏附分子对流动具有不同的响应性；湍流是引起ECs形态结构和功能行为的病理学改变的重要原因。     

内皮细胞相关黏附分子的研究进展

白细胞黏附于血管内皮细胞并渗出内皮细胞层是免疫反应的关键和重要步骤.此过程不仅需要激活白细胞及其膜表面黏附分子,而且需要内皮细胞上相关的黏附分子的调控.目前研究已由研究黏附生理过程转向研究此过程的分子机制.本文主要介绍与此过程相关的内皮细胞黏附分子的基因表达、信号转导通路调控以及对细胞功能的影响等的最新研究进展.     

联胺诱导培养的人内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1

细胞黏附分子涉及许多生理和病理过程 ,如动脉粥样硬化 (AS) [1] 。有些因素可能诱导细胞黏附分子的表达 ,如氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)诱导培养的内皮细胞表达血管细胞黏附分子 1(VCAM 1) [2 ] 。这提示细胞黏附分子可能是导致AS的一种重要因素。我们拟用氧化剂联胺处理培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,诱导其脂质过氧化损伤 ,观察其VCAM 1mRNA和蛋白表达 ,为抗氧化剂防治AS提供实验依据。一、材料与方法1 HUVEC培养与分组 :用胰酶消化法获取HUVEC ,培养于M199培养基 (Gibco公司产品 ) ,含 5 %新生牛血清、10 %胎牛血清、5 …     

免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管和不同血管内皮细胞的表达

目的比较免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管、大血管和微血管内皮细胞的表达特点,探讨免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管内皮细胞表达的意义。方法从狗的胸导管、颈总动脉、颈内静脉、肺微血管分离内皮细胞,利用免疫荧光标记法检测PECAM-1、ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1和CD44在各种内皮细胞的表达,在荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜下观察,并用图像分析仪分析表达强度。结果动脉、静脉和肺微血管内皮细胞表达PECAM—1、ICAM—1、ICAM-3、VCAM—1和CD44。其中,ICAM-1和ICAM-3的表达较弱。VCAM—1在动脉和肺微血管内皮细胞的表达比静脉强。淋巴管内皮细胞表达PECAM—1、ICAM—1、ICAM-3和CD44,未观察到VCAM—1的表达。ICAM-3和CD44的表达比血管内皮细胞强。结论与动脉、静脉和微血管内皮细胞比较,淋巴管内皮细胞不表达VCAM—1,而ICAM-3和CD44表达较强,这有助于解释淋巴细胞和肿瘤细胞与淋巴管内皮的黏附以及淋巴管新生的机制。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

目的:探索一种简便易行、可培养出高纯度大鼠脑微血管内皮细胞的方法。方法:1月龄SD大鼠,解剖得到大脑皮质,密度离心法获得较纯的脑微血管段后进行原代培养,传代采用差速消化和贴壁方法进行纯化。通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测对培养细胞进行鉴定。结果:密度离心法分离出的大量微血管段呈"串珠样"结构,培养24h可见短梭形、多角形细胞,8～10天基本融合。第2代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达90%。结论:原代细胞采用低分子量葡聚糖加Percoll密度离心法、传代细胞采用差速消化和差速贴壁法纯化可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。     

蜂胶水提物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

目的:采用TNF-α诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUCECs)活化,观察蜂胶水提物(WEP)对血管内皮细胞黏附分子表达的影响,从而探讨蜂胶抗动脉粥样硬化的作用及其机制。方法:用50μg/L TNF-α诱导体外培养HUVECs损伤,用50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L WEP分别进行干预6 h、12 h、24 h,利用流式细胞仪检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1表达。结果:与对照组比较,模型组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显升高(P0.01)。与模型组比较,100 mg/L WEP组和200 mg/L WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显降低(P0.01)。不同浓度WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度随WEP浓度的增加下调。析因分析结果显示,用200 mg/L WEP和氟伐他汀钠(FS)联合预处理组与单一药物预处理组比较,ICAM-1和VCAM-1活性明显降低(P0.01)。结论:WEP能够减少ICAM-1和VCAM-1的表达,且在一定的范围内,有随WEP浓度升高和作用时间延长效应增强的趋势。WEP与FS联合用药,对抑制ICAM-1和VCAM-1表达有协同作用。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形。7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性．且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型．也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

肺微血管内皮细胞的分离及其在单核细胞粘附中的应用

目的 :研究肺微血管内皮细胞的分离和纯化方法 ,探讨内皮细胞的透明质酸对于单核细胞粘附的作用。方法 :用两次植块法分离狗和大鼠的肺微血管内皮细胞。通过粘附实验 ,观察单核细胞在内皮细胞单层上的粘附。结果 :第二次植块 3天后 ,内皮细胞自肺组织块边缘迁出 ,2周后内皮细胞生长形成单层。在扫描电镜下 ,内皮细胞表面有许多微绒毛和小凹。用透明质酸酶消化内皮细胞表面的透明质酸后 ,粘附的单核细胞数显著减少。结论 :两次植块法是一种理想的肺微血管内皮细胞的分离和纯化方法。微血管内皮细胞表面的透明质酸促进单核细胞的粘附     

小细胞肺癌细胞诱发人脑微血管内皮细胞紧密连接的开放

目的小细胞肺癌易发生脑转移,但其机制尚不完全清楚,本文探讨小细胞肺癌细胞对人脑微血管内皮细胞单层细胞间紧密连接开放的作用。方法应用免疫荧光技术观察人脑微血管内皮细胞间紧密连接结构改变;应用Western blot技术分析小细胞肺癌细胞与微血管内皮细胞单层共培养时紧密连接蛋白occludin的可溶性片段和不可溶性片段在内皮细胞紧密连接处的分布情况;应用跨内皮迁移实验及辣根过氧化物酶渗漏实验分析小细胞肺癌细胞与内皮细胞单层共培养后其跨内皮细胞单层的迁移能力和内皮单层渗透性的改变;利用ROCK特异性抑制剂Y27632,分析Rho/ROCK信号通路是否参与小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结果小细胞肺癌细胞能够通过人脑微血管内皮细胞单层迁移,在0h到12h之间随培养时间的延长小细胞肺癌细胞的迁移率逐渐增加;共培养8h时人脑微血管内皮细胞紧密连接处紧密连接结构蛋白(ZO-1和occludin)表达减少,通透性明显增加;ROCK特异性抑制剂Y27632能够阻断小细胞肺癌细胞引起的内皮细胞间紧密连接处紧密连接结构蛋白ZO-1和occludin表达减少、内皮单层通透性的增加及小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结论小细胞肺癌细胞与人脑微血管内皮细胞单层共培养诱发人脑微血管内皮细胞间紧密连接的开放,利于小细胞肺癌细胞的跨内皮单层迁移。     

VP1-Binding Protein Glucose-regulated protein 78 as an important mediator for Enterovirus 71 infecting Human Brain Microvascular Endothelial Cells

Purpose: Enterovirus 71 (EV71) is one of the main pathogens causing hand, foot and mouth disease, which could even induce severe brain damage in some patients. As the underlying mechanism of the invasion and replication process still remains largely unknown, we investigated the role of candidate proteins expressed during EV71 invasion in human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) to delineate the pathophysiological mechanism of EV-71 infection. Materials and Methods: Ninety-one candidate EV71-associated proteins which could bind the major capsid protein (viral protein 1 [VP1]) of EV71 on the HBMEC were identified by applying an analysis of glutathione-S-transferase pull-down coupling with liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Seventy-eight kDa glucose-regulated protein 78 (GRP78) binding to the VP1 protein was further validated by co-immunoprecipitation, immunofluorescence and western blot analysis. To explore the role of GRP78 in EV71 infection, GRP78 was knocked down and overexpressed in HBMEC and was verified by TCID50 assay. Results: LC-ESI-MS/MS-identified 91 proteins were subjected to gene ontology analysis, and on molecular and biological function analysis revealed GRP78 act as an important binding protein in mediating EV71 infection. In addition, immunofluorescence demonstrated the co-localisation of GRP78 and VP1 in cytoplasm of the infected HBMEC. The TCID50 assay showed that knockdown of GRP78 could attenuate the replication capacity of EV71 in HBMEC, and the overexpression could increase the virus titre in HBEMC at 24 h post-infection suggesting that GRP78 was associated with the replication capacity of EV71 in HBMEC. Conclusion: These findings provided evidence that GRP78 plays an important role during the progression of EV71 infection as a mediator in HBMEC.     

大鼠肺微血管内皮细胞培养及其粘弹性研究

为了建立肺微血管内皮细胞培养方法 ,研究肺微血管内皮细胞粘弹性。我们取大鼠肺周边组织 (宽度不应大于 1.5 mm) ,将组织剪成 1.5 mm× 1mm× 1mm的组织块 ,贴入无菌的 2 5 cm3培养瓶 ,每瓶 10～ 15块 ,同时加入含 2 0胎牛血清、肝素 90 U/ml、L-谷氨酰胺 4mmol、青霉素 10 0 U/ml和链霉素 10 0 μg/ml的 DMEM培养基 3ml,放入 37℃二氧化碳培养箱中静置培养 ;8h后翻转培养瓶 ,6 0 h后取出肺组织块 ,接着继续培养 2～ 4d后进行传代。最后消化分离肺微血管内皮细胞 ,用微管吸吮系统研究肺微血管内皮细胞粘弹性。结果显示 :肺微血管内皮细胞通过倒置相差显微镜观察 ,细胞呈鹅卵石镶嵌状排列 ,状如梭形或多角形 ,大小均匀 ,胞核清晰 ,呈卵圆形 ,胞浆丰富 ; 因子相关抗原免疫荧光染色呈阳性 ;肺微血管内皮细胞弹性模量 K1 =49.3± 9.2 Pa、K2 =73.2±2 4.8Pa、粘性系数 μ=19.2± 7.2 Pa.s。这些结果表明用组织块法培养肺微血管内皮细胞是可行的 ,肺微血管内皮细胞表现出较大的刚性     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养及缓激肽的作用靶细胞探讨

目的建立稳定的原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法,并在体外探讨不同剂量缓激肽的作用靶细胞,进一步阐释缓激肽开放血脑和血肿瘤屏障的机理。方法运用免疫荧光测定原代培养的脑血管内皮细胞、星形胶质细胞及C6胶质瘤细胞在不同剂量缓激肽作用前后的细胞内钙离子变化,根据给药前后的荧光改变来确定不同剂量缓激肽的作用靶点细胞。结果小剂量缓激肽(终浓度:1μmol/L)可以引起C6胶质瘤细胞内的钙离子水平升高,而只有大剂量(终浓度:10μmol/L~1mmol/L)缓激肽才能触发星形胶质细胞内的钙离子水平升高,脑微血管内皮细胞对大、小剂量缓激肽均无任何反应。结论缓激肽的直接作用靶点是胶质细胞及C6胶质瘤细胞,缓激肽调节脑血管内皮细胞通透性的作用可能需要某些细胞间信使的参与。     

辛伐他汀对不同氧供条件下大鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻及MMP-9表达的影响

目的:观察在常氧、短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下,辛伐他汀对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)跨内皮细胞电阻(TEER)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法:原代分离培养SD大鼠BMECs,随机分为常氧组、短暂缺氧组、持续缺氧组、复氧组,各组均实施辛伐他汀0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L3种浓度预处理。观察各组细胞形态学及增殖活性变化;采用TEER评估各组通透性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9蛋白表达。结果:短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs细胞受损逐渐加重,MMP-9表达逐渐增加,TEER及细胞增殖活性逐渐下降。辛伐他汀干预能不同程度提高TEER并抑制MMP-9蛋白的表达,使细胞增殖活性提高。但这种抑制MMP-9的作用对短暂缺氧大鼠BMECs的TEER值及细胞增殖活性无显著改善。结论:辛伐他汀能通过抑制MMP-9蛋白的表达来提高持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs的TEER,而对短暂缺氧后TEER的改善作用不明显。     

溶血磷脂酰胆碱对内皮细胞表面粘附分子表达的影响

大量的单核细胞募集是动脉粥样损伤形成的早期表现之一,相关的内皮细胞粘附分子在其中具有积极作用。本文研究了溶血磷脂酰胆碱（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ,Ｌｙｓｏ－ＰＣ）对培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣｓ）膜上细胞间粘附分子－（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１,ＩＣＡＭ－１）、Ｅ选择素（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ     

流体切应力对内皮细胞粘附分子表达的影响

在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生发展中各种白细胞,包括单核细胞对内皮细胞的粘附可能起着较为重要的作用。在体内,血流切应力对内皮细胞的形态和功能有重要影响。为了阐明流体切应力对内皮细胞表面粘附分子表达的影响,本文研究了流体切应力(2.23～6.08dyne/cm     

几丁聚糖拮抗TNF促进猪主动脉内皮细胞与单核细胞的黏附作用

目的 研究肿瘤坏死因子(TNF)对体外培养的猪主动脉内皮细胞(PAEC)与单核细胞(MC)黏附的影响及几丁聚糖的拮抗作用。方法 通过测定MC髓过氧化物酶活性的方法，对黏附于PAEC单层上的MC进行定量。结果 TNF在5～500U／ml时呈剂量依赖性地诱导PAEC与MC的黏附，TNF浓度为250U／ml时促黏附达最大值(81．98％)。TNF与内皮细胞共育1h，即可明显促进黏附作用(66.8％)，4h时达最大刺激效应(77．5％)。几丁聚糖在浓度为20～2000μg／ml时，呈剂量依赖性地拮抗TNF诱导的黏附作用，在2000μg／ml时抑制率达22．99％。结论 几丁聚糖具有抑制由TNF诱导的PAEC与MC黏附的作用。