转基因小鼠在乙肝分子生物学及免疫学研究中的应用

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)是严重损害人健康的病毒性肝炎重要致病因子。ＨＢＶ自然感染宿主范围狭窄 ,建立合适的动物模型很是困难 ,在很大程度上限制了对乙肝的深入研究。ＨＢＶ转基因小鼠 ,对乙肝研究起了极大的推动作用。本文就ＨＢＶ转基因小鼠在乙肝分子生物学及免疫学研究中     

HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻保存研究

目的研究OPS法对不同基因型的HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻的效果，为建立转基因小鼠胚胎库奠定基础。方法采用乙二醇作为冷冻保护剂，以野生型P21^ / 小鼠为对照，用OPS法对P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx两种HBV转基因小鼠3．5d的胚胎进行玻璃化冷冻，并比较不同基因型小鼠的超数排卵数，胚胎的复苏率及发育率。结果P21^ / 、P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx小鼠平均超排数分别为27．89、15．56、9．14枚；复苏率分别为88．7％、81．1％、80．3％；发育率分别为82．6％、79．4％、56．6％。结果表明HBV转基因小鼠的超排数明显低于野生型小鼠的超排数，解冻后三种小鼠的胚胎复苏率之间无显著差别，而解冻后发育率，P21^HBx／HBx小鼠要明显低于其它两种小鼠。结论超排数、胚胎复苏率及解冻后发育率受小鼠的基因型影响。     

当归多糖对HBV转基因小鼠树突状细胞作用

目的研究当归多糖对HBV转基因小鼠免疫调节作用。方法采用1％当归多糖（ASP）腹腔注射，每周2次，2周后摘取小鼠脾脏制备淋巴细胞，MTT（噻唑蓝粉剂）法观察ASP对淋巴细胞的毒性作用；经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和白细胞介素-4（IL-4）培养转基因小鼠脾脏来源树突状细胞（DC），ELISA法检测DC分泌IL—12以及刺激混合淋巴细胞反应T淋巴细胞分泌IL-10、IFN-γ的含量。结果ASP在0—625mg／L浓度对HBV转基因小鼠无毒性作用，并能显著促进HBV转基因小鼠DC分泌IL—12，在混合淋巴细胞反应中，能有效促进T淋巴细胞分泌IFN-γ并抑制IL—10的分泌，从而上调DC功能。结论当归多糖对HBV转基因小鼠树突状细胞功能具有上调作用，可能是当归多糖免疫调节机制之一，为当归多糖在慢性乙型肝炎临床应用提供了实验依据。     

异甘草酸镁在HBV转基因小鼠中的药效学研究

探讨异甘草酸镁对乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠的治疗作用及对细胞免疫和肝脏炎症的影响。通过检测两组小鼠血清天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性的变化,血清乙肝表面抗原(HBsAg)、肝脏组织HBsAg mRNA 的差异以及肝脏组织的病理形态学变化考察HBV转基因小鼠的肝脏炎性病变和异甘草酸镁的药效。利用流式细胞术进行外周血淋巴细胞分群以及流式细胞小球微阵列术(CBA)检测血清细胞因子,探索异甘草酸镁减轻HBV转基因小鼠肝脏炎性病变的作用机制。结果表明,以血清转氨酶活性将HBV转基因小鼠分组后,连续给药35 d,异甘草酸镁组［15 mg/(kg·d)］小鼠血清转氨酶水平显著低于对照组(P<0.05);血清HBsAg蛋白和肝脏组织HBsAg mRNA均随时间延长而升高,但两组间无显著差异;肝脏的主要病理改变为肝细胞肿胀、坏死和局灶性炎细胞浸润,异甘草酸镁组小鼠的肝脏病理形态学改变轻于对照组。异甘草酸镁组小鼠血液中CD8⁺细胞数量显著少于对照组(P<0.05),CD4⁺/CD8⁺细胞比例显著高于对照组(P<0.05);异甘草酸镁组小鼠血清中促炎细胞因子含量显著降低(P<0.05)。本研究表明,异甘草酸镁可以调节HBV转基因小鼠的免疫功能,减少肝组织炎性细胞浸润和肝细胞损伤,但不影响肝细胞HBsAg表达。     

HBV转基因小鼠研究进展

流行病学研究证实，作为全世界第五位最常见的恶性肿瘤，肝细胞癌（HCC）的发生与人乙型肝炎病毒（HBV）有直接关联，我国尤甚。HBV是影响人类生存最重要的病毒之一，全世界至少有3．5亿人感染，它是一种部分双链的环状DNA病毒，具有随机整合入宿主基因组中的能力。通常认为，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和转录反式激活蛋白（HBx）是HBV病毒基因组中比较重要的致病因素，但二者的功能却有很大差异。     

复制型HBV转基因小鼠肝组织HBcAg分布特性分析

目的探讨复制型HBV转基因小鼠肝组织HBcAg的分布特性。方法通过图像分析软件，对转基因小鼠的肝组织HBcAg在肝内不同区域以及肝细胞核内的表达与分布进行系统和量化分析。结果①HBcAg在复制型HBV转基因小鼠肝组织内高表达，弥散分布，主要为胞核型，少数为胞浆型；②在40倍物镜下，200万个像素单位内，肝组织HBcAg阳性细胞核平均个数92．85±50．15，阳性细胞核平均染色面积（70965．80±37919．20）像素单位，阳性细胞核平均光密度0．67±0．03，光密度比值2．37±0．09；③在肝细胞核内，HBcAg的表达不均匀，核周边的表达量较多。结论四项指标经统计分析，在门管区和中央静脉周围两个区间，HBcAg阳性细胞核平均个数、平均染色面积、平均光密度以及阳性细胞核与背景的光密度比值均没有统计学差异，且性别差异不显著。     

Adr型HBV全基因转基因小鼠DC和T细胞功能的研究

目的方法：通过对分离Ａｄｒ型ＨＢＶ全基因转基因小鼠的脾脏淋巴细胞和树突状细胞,并研究其对ＣｏｎＡ,ＨＢｅＡｇ,ＣｏｎＡ＋ＨＢｅＡｇ刺激的应答能力。结果：发现ＨＢＶ转基因小鼠对ＣｏｎＡ的应答基本正常,但对ＨＢｅＡｇ,ＣｏｎＡ＋ＨＢｅＡｇ的应答明显低于对照组,说明ＨＢＶ转基因小鼠ＤＣ和Ｔ细胞对ＨＢＶ存在特异性的免疫耐受。     

复制型HBV（ayw）转基因小鼠血清中病毒颗粒的免疫电镜检测

目的检测复制型HBV（ayw）转基因小鼠血清中HBV病毒颗粒。方法应用密度梯度离心收集病毒颗粒并应用免疫电镜检测。结果发现了直径22nmHBsAg颗粒和45nm左右的Dane颗粒。结论本转基因小鼠模型能继续复制，组装并分泌HBV病毒颗粒。     

乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠的初步建立

HBx基因为HBV基因组上的一个开放读框,可编码具有转录反式激活作用的蛋白(HBxAg).已证实在体外HBxAg可使哺乳细胞株发生恶性转化[1].为了探索在体内HBxAg转化细胞的作用,国外数个实验室已相继建立了HBx转基因鼠模型[2,3].为研究HBx基因在肝细胞癌变过程中的确切作用提供有效的动物模型,我们初步建立了携带乙型肝炎病毒X基因的转基因小鼠,现报道如下.     

大剂量重组HBsAg对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

目的 利用免疫耐受HBV转基因小鼠动物模型研究大剂量基因重组HBsAg对其免疫调节作用，观察对HBV基因表达的影响。方法 比较不同免疫次数、免疫周期、免疫剂量对转基因小鼠所诱生的Th1类细胞因子和T细胞增殖的影响，同时检测血清中HBsAg和HBV DNA的含量。结果 多次免疫9个月后的IL一2，IFNγ，T细胞增殖的水平分别是免疫1周时的2，17，2倍，同时疫苗组的HBsAg的滴度在6个月时较对照组明显降低，9个月时显著降低，HBV DNA的检测结果是疫苗组下降10^2的有3只，而对照组没有。9周内免疫一次和两次，高、中、低剂量组与对照组所诱生的IL-2水平差异均无显著性。结论 大剂量的基因重组HBsAg可以诱导出高水平的Th1类细胞因子，抑制HBV的基因表达，打破免疫耐受，为乙肝疫苗的临床抗HBV治疗奠定了理论基础。     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

Adr型HBV全基因转基因小鼠DC和T细胞功能的研究

目的方法 :通过对分离Adr型HBV全基因转基因小鼠的脾脏淋巴细胞和树突状细胞 ,并研究其对ConA ,HBeAg ,ConA HBeAg刺激的应答能力。结果 :发现HBV转基因小鼠对ConA的应答基本正常 ,但对HBeAg ,ConA HBeAg的应答明显低于对照组 ,说明HBV转基因小鼠DC和T细胞对HBV存在特异性的免疫耐受。     

HBV转基因小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的研究

目的 通过对HBV转基因小鼠CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量和免疫抑制功能的研究,探讨CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝免疫耐受中的作用.方法 用流式细胞术对12只HBV转基因小鼠和12只正常小鼠外周血CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞的频率进行检测;磁珠分选小鼠脾CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞,分为HBsAg刺激组和ConA刺激组体外单独和共培养,ELISA方法检测诱生的细胞因子IL-2.结果 与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠外周血CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量差异无统计学意义(P＞0.05).HBsAg刺激组,CD4+CD25-T细胞单独或共培养,HBV转基因小鼠CD4+CD25-T细胞诱生IL-2水平显著低于正常小鼠(P＜0.01);ConA刺激组,HBV转基因小鼠CD4+CD25-T细胞诱生IL-2水平与正常小鼠相比则差异无统计学意义(P＞0.05);两组小鼠CD4+CD25-T细胞单独培养时诱生IL-2水平均显著高于共培养(P＜0.01).结论 与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量和免疫抑制功能差异无统计学意义,但T细胞水平对乙肝病毒存在特异性免疫耐受.CD4+CD25+调节性T细胞可抑制CD4+、CD8+T细胞.     

转基因小鼠技术在肿瘤研究中的应用与进展

转基因动物 (transgenicanimals)是指用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定地整合并可以表达和传与后代的一类动物。自 1980年Gordon等[1 ] 将猿猴病毒 (SV4 0 )和人单纯疱疹病毒 (HSV)的tk基因 (thymidinekinase) ,即胸腺嘧啶核苷激酶基因 ,整合后的质粒直接注入到小鼠受精卵原核中 ,首次成功的培养出转基因小鼠 (transgenicmice ,TGM)后 ,先后出现转基因大鼠、兔、鱼、鸡、羊、猪、牛等。1　转基因小鼠技术自转基因小鼠技术创立以来 ,该项技术和方法经过不断改进和发展 ,并被迅速应用于肿瘤研究。具体方法是将某种与肿瘤相…     

胸腺肽对HBV转基因小鼠表达HBV DNA的影响

应用胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠进行腹腔内注射（３ｍｇ／只）连续３个月，同时设促肝细胞生长素及生理盐水对照组，定期取血检测ＨＢＶＤＮＡ，结果发现胸腺肽组ＨＢＶＤＮＡ阴转率为２２％～５５％，停药２２ｄ后阴转率为２２％，而对照组小鼠ＨＢＶＤＮＡ无阴转，结果提示胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠表达ＨＢＶＤＮＡ有抑制作用。     

不同引物在血液PCR筛选HBV转基因小鼠中效果评价

本研究是利用本公司已构建的HBV adr亚型转基因小鼠,针对HBV SI、S和C抗原编码区基因的不同特点分别设计三对引物,通过对比其血清PCR结果,以探究快速、有效筛选该HBV adr亚型转基因小鼠的方法。     

单克隆抗体诱发乙肝转基因小鼠肝组织损伤

目的：诱导整合有乙型肝炎病毒（HBV）全基因组、无病理学反应的转基因小鼠产生病理学改变，建立研究急性肝炎发生机制及治疗药物筛选的转基因动物模型。方法：采用尾静脉注射方法将3种HBV单克隆抗体HBsAb、HBeAb、HBcAb分别或混合导入整合有HBV全基因组的转基因小鼠体内，使之与体内的抗原结合产生免疫学反应，随后进行血清学及常规病理学的研究。结果：3种单克隆抗体单独或混合处理均引起HBV转基因小鼠肝细胞的病理学损伤，以HBsAb及HBsAb HBcAb混合处理组损伤较为严重；但小鼠血清转氨酶基本表现正常。结论：体液免疫反应可以诱导HBV转基因小鼠组织细胞发生损伤，并产生与急性肝炎相似症状的病理学改变，HBsAb及HBsAb HBcAb处理的HBV转基因小鼠可以作为研究急性肝炎发生机制的动物模型。     

上海转基因小鼠模型研发平台通过验收

上海转基因和基因剔除小鼠模型研发平台，新近通过专家验收。