稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的：探讨转染外源野生型p53基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。并了解p53基因与HeLa细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导，将含人野生型p53cDNA的cCB6.p53质粒导入人宫颈癌HeLa细胞株中，筛选阳性克隆，用免疫组化ABC法检测p53基因的表达情况，加入顺铂72小时后，用四唑盐比色试验检测存活的HeLa细胞数。结果：在G418选择培养基中培养两周后，成功地生长出阳性细胞克隆，免疫组化法证实外源性p53基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代，p53基因转染对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用。p53表达阳性的HeLa细胞对顺铂的敏感性明显增加，结论：野生型p53基因转染能使HeLa细胞出现生长抑制和化疗敏感性增强。     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

外源性野生型p53基因对白血病细胞作用及对白血病细胞因子表达的调控

野生型 p5 3基因 (简称 wt- p5 3基因 )是一种重要抑癌基因 ,wt- p5 3功能失活与肿瘤的发生密不可分 ,通过重建 wt-p5 3功能治疗恶性肿瘤是近年来基因治疗热点。 p5 3基因是人类肿瘤中基因改变频率最高的一种基因 ,几乎所有组织均可发生 p5 3突变 ,血液系统的肿瘤也不例外。综合文献 ,急性髓细胞白血病 (AML)患者伴有 17号染色体异常 [i17(q) ]者p5 3基因点突变的发生率可达 40 % ,而大多数的白血病细胞系如 HL6 0、K5 6 2、CMK、U937均可检出 p5 3基因严重缺失或突变。慢性粒细胞白血病慢性期 ,p5 3基因发生重排、缺失或点突变的比率低…     

外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性

目的　建立动脉粥样硬化不稳定性斑块的动物模型。方法　 6 4只雄性纯种新西兰大白兔随机分成A组 (5 4只 )与B组 (1 0只 ) ,A组用球囊损伤腹主动脉 高脂喂养 1 0周 ,B组仅给予高脂喂养 1 0周。于 8周末将A组随机分为A1和A2两个亚组 ,在腹主动脉斑块形成处分别转染携带人野生型 p5 3基因或LacZ基因的重组腺病毒载体 ,2周后A1 (p5 3基因 )和A2 (LacZ基因 )组各处死1 0只 ,观察斑块自发破裂情况。分别给予余下的兔中国斑点蝰蛇毒 (CRVV)和组胺药物触发斑块破裂 ,然后将兔处死取出腹主动脉进行病理学及免疫组化检查。实验开始及处死前进行血脂检查。结果　A1组转染 p5 3阳性细胞数比其他两组明显增加 (分别为 32 4 %± 1 0 2 %,1 5 8%± 3 6 %,1 6 2 %± 6 7%,P均 <0 0 0 1 ) ,细胞凋亡率明显高于其他两组 (分别为 2 5 %± 0 8%,1 0 %±0 3%,0 9%± 0 4 %,P均 <0 0 1 ) ,斑块纤维帽显著变薄 (P <0 0 5 ) ,血管平滑肌细胞减少 ,巨噬细胞聚集 ,药物触发后有 1 2只共 2 0处发生斑块破裂及血栓形成 ,A2组中 ,药物触发后仅 5只 7处发生斑块破裂。B组未见斑块破裂及血栓形成。结论　应用外源性人野生型p5 3基因转染动脉硬化兔可导致斑块的不稳定性 ,药物触发后出现斑块破裂及血栓形     

急性白血病细胞p53基因表达

目的：检测急性白血病细胞内ｐ５３基因表达情况。方法：３Ｈ－ｄＡＴＰ标记基因探针的斑点杂交。结果：急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）表达ｐ５３ＲＮＡ水平与正常对照类似，急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）中５９．４％表达低水平ｐ５３或表达缺失，ｐ５３表达缺失在Ｍ４、Ｍ５中多见。结论：急性白血病细胞中存在ｐ５３ＲＮＡ表达异常。     

外源性野生型p53基因对sW1990细胞调控基因表达的影响

目的：探讨外源性野生型p53基因对胰腺癌SW1990细胞调控基因表达的影响与可能机制。方法：分别采用RT-PCR和Western blot方法检测sw1990细胞、重组质粒p53-GFP转染的sw1990细胞和正常胰腺组织中p53、p21waf1/cip1、bax、puma、pten及mdm2 mRNA和蛋白的表达。结...     

p53截短突变群的建立及其在HeLa细胞的表达

目的:建立一组p53截短突变群,分析缺失突变对P53蛋白质功能的影响.方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR定点突变技术,建立一组P53蛋白质N端和(或)C端缺失的截短突变群,构建真核表达载体,基因转移HeLa细胞,分析转移基因表达及p53下游相关基因表达.结果:构建的p53截短突变群在HeLa细胞中表达,并对p53下游相关基因的表达模式产生一定的影响.结论:p53截短突变群可以作为一个研究p53与下游基因相互作用的良好工具,对于研究p53的功能调节机制有重要的价值.     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对 SKOV3细胞内端粒酶活性无影响     

野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的　探讨转染外源野生型 p5 3基因对宫颈癌 He L a细胞生长的抑制作用 ,并了解 p5 3基因与He L a细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法　利用脂质体介导 ,将含人野生型 p5 3c DNA的 p CB6 .p5 3质粒导入人宫颈癌 He L a细胞株中 ,筛选阳性克隆 ,用免疫组化 ABC法检测 p5 3基因的表达情况。加入顺铂 72小时后 ,用四唑盐比色试验检测存活的 He L a细胞数。结果　在 G418选择培养基中培养两周后 ,成功地生长出阳性细胞克隆。免疫组化法证实外源性 p5 3基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代 ,p5 3基因转染对 He L a细胞的生长有明显的抑制作用。p5 3表达阳性的 He L a细胞对顺铂的敏感性明显增强。结论　野生型 p5 3基因转染能使 He L a细胞出现生长抑制和化疗敏感性增强     

抑癌基因p16和p53在膀胱癌中的表达及意义

目的研究膀胱癌中抑癌基因p16和p53的表达及其与临床病理特征及预后的关系.方法应用免疫组织化学ABC法和微波炉抗原修复法对69例膀胱移行细胞癌标本中抑癌基因p16和突变型p53蛋白产物进行检测.结果69例膀胱癌标本中37例p16检测阳性(53.62%),30例p53检测阳性(43.48%).p16阳性率在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级肿瘤中分别为69.57%、56.25%和21.43%,在Tis～T1期和T2～T4期肿瘤中分别为70.59%和37.14%.p53阳性率在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级肿瘤中分别为26.09%、46.88%和64.29%,在Tis～T1期和T2～T4期肿瘤中分别为29.41%和57.14%.随着膀胱癌病理分级、临床分期的上升,p16表达阳性率逐渐下降,p53阳性率逐渐上升.p16阴性或p53阳性患者的肿瘤复发率和病死率分别高于p16阳性或p53阴性患者.结论p16和p53的表达状况与膀胱癌生物学行为密切相关.p16和p53的免疫组化检测具有评估膀胱癌预后的价值,可作为膀胱癌的生物学瘤标.     

食管鳞癌和宫颈鳞癌组织中p53蛋白过度表达及其与放疗效果的关系

目的:探讨p53蛋白过度表达与食管鳞癌和宫颈鳞癌临床放射敏感性的关系.方法:免疫组化法研究52例食管鳞癌和宫颈鳞癌标本中p53蛋白过度表达状况,并分析其与近期放疗效果的关系.结果:p53蛋白在食管鳞癌和宫颈鳞癌中的过度表达分别为52.38%和35.48%,过度表达率在高分化鳞癌中较中低分化者低(P＜0.05),与病期无关(P＞0.05).在宫颈鳞癌,p53蛋白过度表达者放疗效果较差(P＜0.05),食管鳞癌p53蛋白过度表达与放疗效果间无明显关系(P＞0.05).结论:p53蛋白过度表达与食管鳞癌和宫颈鳞癌放射敏感性有关,但不是惟一影响因素.     

p73和p53在肾癌中的表达及其意义

目的:探讨p73、p53蛋白在肾癌中的表达及其相关性及与肾癌临床分期、病理分级、预后之间的关系。方法:采用免疫组织化学技术对46例肾癌p73、p53表达进行对比研究。结果:p73、p53蛋白阳性表达与各病理类型、病理分级之间差异元显著性(P>0.05)。p73、p53蛋白阳性表达与临床分期之间差异有显著性(P<0.05)。p73与p53蛋白共同阳性表达与肾癌患者预后显著相关(P<0.05)。结论:p73和p53阳性表达与肾癌病理类型、病理分级无关而与临床分期有关。肾癌p73和p53共同阳性表达患者生存率明显低于其余患者,可能是判断肾癌预后的指标之一。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，并能在选择培养基中生长     

p53基因在口腔癌中的表达及其与临床,病理和预后间的关系

利用免疫组化技术对１１１例原发性人口腔粘膜鳞癌的ｐ５３蛋白表达进行了研究，并探讨了ｐ５３蛋白表达同口腔鳞癌的临床、病理和预后间的关系。研究结果表明：（１）口腔鳞癌有较高的ｐ５３蛋白阳性表达率（６９．４％），ｐ５３蛋白阳性表达可作为口腔癌癌变发生的一个标志。（２）ｐ５３蛋白表达情况同口腔癌的发生部位、性别、年龄、肿瘤大小、病理分级及淋巴结转移情况均无直接关系，同临床分期的关系也不十分明确。（３）ｐ５３蛋白染色阳性反应越强的口腔癌患者，其３年、５年生存率越差。（４）单因素ＣＯＸ风险比例模型分析证实ｐ５３蛋白阳性反应强弱并非影响口腔癌患者预后的主要因素，多因素ＣＯＸ模型分析未能建立有效的生存函数或危险率函数，说明所选指标及ｐ５３染色均不是影响口腔癌预后的非常有效的风险指标。     

肿瘤抑制基因p53及Rb在鼻咽癌中的表达

为观察ｐ５３基因和Ｒｂ基因与鼻咽癌发生的关系，应用聚合酶链反应－单链构型多态分析技术（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术），检测３３例鼻咽癌组织、４例鼻咽部炎性组织及３例正常鼻咽部组织中ｐ５３基因第７，８外显子的突变。结果显示，在３３例鼻咽癌中有７例存在ｐ５３基因第８外显子的突变，突变率为２１．２％。在第７外显子中未检测出突变发生。应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，对Ｒｂ基因在鼻咽癌中存在状态进行研究。结果表明，在１３例鼻咽癌组织中有１１例鼻咽癌组织有Ｒｂ基因的缺失或明显减弱，提示ｐ５３基因突变及Ｒｂ基因的缺失而导致的基因失活与鼻咽癌的发生有密切关系。     

食管鳞癌和宫颈鳞癌组织中p53蛋白过度表达及其与放疗效果的关系(英文)

目的:探讨p53蛋白过度表达与食管鳞癌和宫颈鳞癌临床放射敏感性的关系。方法:免疫组化法研究52例食管鳞癌和宫颈鳞癌标本中p53蛋白过度表达状况,并分析其与近期放疗效果的关系。结果:p53蛋白在食管鳞癌和宫颈鳞癌中的过度表达分别为52.38％和35.48％,过度表达率在高分化鳞癌中较中低分化者低(P<0.05),与病期无关(P>0.05)。在宫颈鳞癌,p53蛋白过度表达者放疗效果较差(P<0.05),食管鳞癌p53蛋白过度表达与放疗效果间无明显关系(P>0.05)。结论:p53蛋白过度表达与食管鳞癌和宫颈鳞癌放射敏感性有关,但不是惟一影响因素。     

食管癌p53基因突变的研究

应用非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法分析了３０例食管癌患者癌组织及相应癌旁组织Ｐ５３基因第５－９外显子，结果发现８例癌组织存在Ｐ５３基因突变。其中的４例为Ｐ５３基因杂合性丢失。部分癌旁组织检测到Ｐ５３基因突变，实验结果表明，Ｐ５３基因突变可能是分管癌癌变的早期遗传学损害，对食管癌的发生起重要作用。