质粒辅助重组腺病毒相关病毒的制备和纯化

目的　探讨制备、纯化 2型重组腺病毒相关病毒 (rAAV2 )载体的简便、高效的方法。方法　采用磷酸钙方法将质粒辅助腺病毒相关病毒重组系统转染HEK2 93T细胞 ,重组rAAV ,通过氯仿 PEG80 0 0 /NaCl 氯仿法结合超滤纯化rAAV病毒。采用蛋白电泳和Western印迹检测病毒外壳蛋白 ,斑点杂交和病毒转染检测病毒的物理和感染滴度。结果　rAAV物理滴度为 2× 10 13 /ml,感染滴度为 5× 10 11/ml。结论　本实验方法简便、高效 ,不需要特殊的仪器设备 ,在普通实验室均可完成 ,制备的病毒纯度和滴度均可以满足动物实验需要。     

一种重组腺病毒载体产生及操作的新方法

目的建立一种快速、高效的产生腺病毒的实验方法。方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)装在穿梭质粒，线性化后与腺病毒骨架载体一起电穿孔转染大肠杆菌，使之同源重组，产生病毒基因组质粒。后Pac酶切，脂质体介导转入293细胞以包装出病毒。扩增后收获病毒，氯化铯密度梯度离心纯化，空斑试验测滴度。结果52个大肠杆菌克隆，其中有1个发生同源重组，产生腺病毒基因组质粒pAdEGFP，转染293细胞，荧光显微镜下产生绿色荧光。病毒纯化后达10^11pfu／ml。结论大肠杆菌内质粒间同源重组的方法可以高效、简便、快捷地产生重组腺病毒载体，是一种很好的制备重组腺病毒载体的方法。     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

重组腺病毒相关病毒载体基因治疗研究进展

在基因治疗的研究过程中，已经报道过的载体包括病毒性载体和非病毒性载体，但都因其目的基因表达的一过性和较为严重的宿主免疫排斥反应而使其应用受限。相比之下，重组腺病毒相关病毒载体（rAAV载体）有明显的优势：（1）对宿主没有致病性；（2）能稳定转染宿主细胞，具有较长时期的基因表达能力；（3）极低的免疫原性；（4）有广泛的宿主群，可转染分化及未分化细胞。本文就rAAV载体在基因治疗中的研究进展做一综述。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用

腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点.rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛.在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著.     

hTRX-PR39重组腺相关病毒载体的构建

目的 探讨hTRX-PR39融合基因在脑缺血疾病中的治疗作用。方法 将已经构建好的hTRX-PR39融合基因插入到具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad,三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体, 收集病毒, 斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果 成功构建重组腺相关病毒质粒pSSCMV/ hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×(1012~1013)PFU/mL。结论 成功构建pSSCMV/ hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并包装较高浓度的重组病毒。     

rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53治疗C6胶质瘤

目的探讨重组腺病毒相关病毒(recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)载体介导血管抑素(Angiastain)及野生型P53(wild typeP53)联合基因治疗C6胶质瘤。方法构建新型载体rAAV-LyoVec,建立裸鼠C6胶质瘤模型,观察各组不同时间肿瘤体积变化,免疫组织化学分析血管抑素、野生型P53及相关蛋白产物的表达情况,RT-PCR确认血管抑素基因在分子水平表达,电镜观察C6细胞凋亡、病毒转染、组织坏死等,从组织,细胞,蛋白,分子水平研究rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53联合治疗C6胶质瘤的有效性。结果rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53基因联合治疗C6胶质瘤,对比血管抑素及野生型P53单基因治疗效果显著(P<0.05),免疫组织化学检测各组细胞P53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表达。RT-PCR法检测血管抑素在rAAV-angiastain-LyoVec组及rAAV-P53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec组表达。结论联合基因治疗是治疗脑胶质瘤的有效...     

NF-κB基因RNA干扰载体的构建

目的:构建核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因的RNA干扰载体,观察其抑制NF-κB蛋白的效率.方法:分别构建大鼠NF-κB基因的pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-NF-κB重组真核表达载体和pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体,用两种重组载体转染COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下观察大鼠NF-κB-绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western免疫印迹方法检测.结果:荧光倒置显微镜观察及Western免疫印迹检测结果均显示随着pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体浓度的增加,NF-κB-绿色荧光融合蛋白表达量逐渐减少.结论:成功构建NF-κB基因的RNA干扰载体.     

表达UGT1A1重组腺相关病毒载体的构建

目的 获得表达胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT1A1）基因；构建UGT1A1重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因，最终连接于pAAV—MCS．双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。并在HEK293T细胞表达，制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了人类UGT1A1基因．构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体。并成功表达于HEK293T细胞。结论 本实验构建的人类UGT1A1重组腺相关病毒将为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。     

Dll4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的：构建一个表达肿瘤血管生成调节基因Delta-like ligand4（Dll4）小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备靶向性抑制Dll4表达的高滴度重组腺相关病毒。方法：将包含肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性小干扰RNA片段的质粒用EcoRI＋SalI双酶切,回收目的片段,将pSNAV2.0质粒用EcoRI＋SalI双酶切后同目的片段连接,脂质体法转染BHK-2l细胞,G418筛选后以辅助病毒感染获取病毒。结果：PCR和测序证实,成功构建包含U6启动子和肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为2.4×10^11 vectorgenome/L高滴度腺相关病毒。结论：成功构建携带Dll4基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体。为下一步探索抗肿瘤血管生成基因治疗的新途径提供实验基础。     

靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的 构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法 根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间（3个月）接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果 经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义（P <0.05）。结论 对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-s...     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体,并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA,RT-PCR获得cDNA,设计引物通过PCR获得PON!基因片段,将其与pGEM—TEasy载体连接,将PON1基因片段切下,插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点,获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP,经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度,并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL,RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒,包装出较高滴度的rAAV—PON1,并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。     

Construction of recombinant adeno-associated virus vector co-expressing hVEGF_(165) and hBMP_7 gene

Objective: To construct recombinant adeno-associated virus co-expressing human vascular epithelial growth factor 165(hVEGF165) and bone morphogenetic protein 7(hBMP7),measure the virus titer and verify the recombination. Methods:The AAV helper-free system was used as basis to generate recombinant AAV. The IRES sequence of plasmid pIRES was cut down and subcloned into ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to construct recombinant plasmid pAAV-MCSa-IRES-MCSb. The hVEGF165 and hBMP7 gene was amplified by PCR and inserted into upstream MCSa and downstream MCSb respectively. Then,recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7,pAAV-RC and pHelper were co-transfected into AAV-293 cells to complete rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 packaging. The GFP labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-hrGFP. The efficiency of AAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured by infecting AAV-HT1080 cells,and the recombinant AAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by PCR of the exogenous interest genes. Results:Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by double digestion. GFP expression in AAV-293 could be observed under fluorescent microscope 72 h after transfection and the system provided a high packing ratio of 95%. The recombinant adeno-associated virus has a high titer of 5.5×1011vp/ml,and AAV-HT 1080 was infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP7 and hVEGF165 gene. Conclusion:Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was successfully constructed with a high virus titer,which may offer foundation for in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP7 co-expression and provide a new method for gene therapy of bone regeneration.     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.