多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

【背景】肺炎支原体是导致儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,长期以来由于其临床表现不特异而容易错过最佳治疗时期。【目的】结合多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)技术和核酸试纸条建立一种快速检测肺炎支原体的方法。【方法】以肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome, CARDS)毒素编码基因为靶基因设计引物和探针,对反应体系的温度、时间等进行优化,评估其敏感性,通过检测肺炎支原体和其余7种病原体分析其特异性,并对35份临床样本进行验证。【结果】MIRA核酸试纸条法在37℃条件下,15 min内便可完成对肺炎支原体的检测,最低检出限为10 copies/μL;除肺炎支原体外,其余7种病原体均不能扩增,特异性较好。以实时荧光PCR检测为标准,MIRA核酸试纸条法对35份临床样本检测后的诊断特异度为100.00%、灵敏度为96.15%、阴性预测值为90.00%、阳性预测值为100.00%。【结论】本研究建立了MIRA核酸试纸条法...     

环介导等温扩增技术对解脲脲原体的临床检测

目的建立并优化环介导等温扩增(LAMP)技术对解脲脲原体(U.urealyticum)的检测,并应用于临床样本分析。方法针对U.urealyticum的urease基因设计LAMP引物;研究LAMP的最适温度、最佳检测时间及灵敏度和特异度;与传统PCR检测进行方法学比对。结果 LAMP技术检测U.urealyticum的最适温度和最佳时间分别是61℃和60 min,并且具有良好灵敏度和特异度,较普通PCR检测的灵敏度高出1 000倍。临床样本检测中,PCR和LAMP技术达到的灵敏度分别为25.00%和87.50%。两种方法的特异度均为100.00%。结论 LAMP与PCR相比在基层检测和大规模筛查方面有显著的优势和巨大的利用价值。     

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立

环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)检测联合应用,建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针。生物素标记的LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应35 min,加上细菌基因组DNA提取步骤,完成检测仅需要80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出创伤弧菌,对哈维氏弧菌等9种水产品常见病原菌的检测均呈阴性;对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×102 CFU/mL或7.4 CFU/反应,是利用外引物建立的常规PCR检测的100倍。结果表明,该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌,可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。     

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体的Meta分析

目的 评估RNA实时荧光核酸恒温扩增（simultaneous amplification and testing,SAT）检测技术检测泌尿生殖道拭子及尿液样本中解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum,UU）阳性率。方法 检索中国学术期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库、维普数据库、PubMed、ScienceDirect和Cochrane图书馆等,收集有关探讨实时荧光核酸恒温扩增检测UU阳性率的所有文献,检索起止时间为1990年1月至2018年8月。拟定入选标准和排除标准,2名研究者分别独立进行文献资料提取及文献质量评估,采用Stata 13.0软件进行Meta分析。结果 共检索出57篇文献,依据入选标准和排除标准,纳入了21篇文献进行分析,包含了33 176例尿液及拭子样本量,所有标本均运用实时荧光核酸恒温扩增对检测样本进行UU检测。Meta分析结果显示,实时荧光核酸恒温扩增检测UU阳性率的汇总检出率（95％CI）为0.44（0.39‒0.49）。结论 实时荧光核酸恒温扩增检测UU具有快速、灵敏的特点,具有很好的判断预后效果,适合临床实验室泌尿生殖道患者UU检测,值得临床进一步推广应用。     

快速检测中药材乌梢蛇LAMP方法的建立

乌梢蛇作为一种名贵中药材,市面上伪品较多,干燥熏黑处理后的样品,更是真伪难辨。本研究致力于开发一套基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)为基础的快速筛查乌梢蛇的方法。本研究以乌梢蛇12srRNA基因序列为基础设计并筛选出1套LAMP引物。通过调整反应条件,建立了对乌梢蛇LAMP的检查方法。结果显示,62℃下连续反应15min左右出现典型的"S"型荧光吸收曲线,实现了对乌梢蛇12srRNA基因序列的特异扩增。根据LAMP灵敏度高的特点,本研究简化了DNA的提取方法,缩短了检测的时间。相对于常规的PCR方法,本研究建立的以快速DNA提取为基础的乌梢蛇LAMP快速筛查方法具有简单、快速、灵敏、对设备要求低等特点,适用于对中药材乌梢蛇的快速筛查。     

空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法检测解脲脲原体的比较

目的:对实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法检测解脲脲体(UU)的结果进行评估,以选择更为快速、准确、实用的临床检测方法.方法:共采集180例疑似泌尿生殖道感染患者的尿液及2份拭子样本,一份拭子样本用液体培养,另一份拭子和尿液样本用 SAT 检测.结果:液体培养和尿液 SAT 检测阳性率均为61.1%,拭子SAT 检测阳性率为63.3%,其中16例拭子培养和拭子 SAT 检测结果不一致,18例拭子培养和尿液 SAT 结果不一致,但与拭子培养比较,拭子和尿液 SAT 结果均无统计学意义(P>0.05,kappa>0.75).结论:SAT 检测 UU 可以尿液为样本,检测效能与液体培养和拭子 SAT 基本相当,但尿液 SAT 法取样方便,检测快速,适临床实验室对 UU 的检测.     

应用PCR技术检测淋球菌,沙眼衣原体及解脲支原体

淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）是导致生殖道感染的重要病原体,我们于1995年11月10日至1997年2月13日间应用PCR技术对诊断为生殖道感染的500例患者的生殖道分泌物进行NG、CT和UU检测,并进行分析,现报告如下：资料和方法三．临床资料;所选病例为泌尿男科及妇科门诊诊断为生殖道感染的患者,共500例,其中男260例,女240例;年龄为19～56岁,平均37.5岁;病程为3天～2年;所选病例皆具有生殖道感染的病状及体征,有305例有性乱史或配偶性乱史．2．方法：NG、CT、UU的检查皆采用聚合酶链反应（PCR）的方法,…     

鸭瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立

目的:建立一种快速、简便、特异性高的鸭瘟病毒(DPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:根据Gen Bank中DPVUI6基因的保守序列设计一套特异性引物,并对反应条件进行优化,建立DPV的LAMP可视化检测方法。结果:建立的LAMP方法对其他鸭常见病原体无扩增反应;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;敏感性可达0.1fg,是常规PCR方法的100倍;扩增反应只须在常规水浴锅中进行,可在1 h内完成。结论:建立的DPV LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DPV感染的快速检测。     

免疫层析试纸条技术及其在转基因检测中的应用

转基因检测是转基因生物安全监管的重要环节。目前需要一种适合于大规模筛查的快速检测转基因成分的方法,以扩大转基因生物安全的监测范围。免疫层析试纸条是一种快速免疫分析技术,是目前常用的快速检测方法之一,具有操作简单、样品量少、检测快速、成本低等优点,已在医学、食品和环境等多个领域广泛应用。介绍了免疫层析试纸条的组成结构、检测原理及免疫标记物,并总结了其在转基因检测方面的研究进展。     

一种基于量子点检测抗CCP抗体的免疫荧光层析法

抗环瓜氨酸多肽 (cyclic citrullinated peptide, CCP) 抗体是类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 早期诊断的重要生物标志物. 为了实现对RA的早期诊断,本研究建立了一种基于CdTe量子点标记技术检测抗CCP抗体的免疫荧光层析法. 将CCP多肽与小牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 连接,再将CCP-BSA和 羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜 (nitrocellulose membrane, NC膜) 上划线,作为检测线 (test line, T线) 和质控线 (control line, C线). 制备量子点并在量子点上标记鼠抗人IgG,喷在玻璃纤维上并烘干,最后组装大卡、切割并封装制成检测试纸条. 应用该试纸条检测了RA患者及健康人血清临床样本200份,以酶联免疫吸附 测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 为对照,计算免疫荧光层析法的检测灵敏度和特异性. 结果显示,建立的量子点免疫荧光层析试纸条检测抗 CCP抗体的灵敏度为97.5 %,特异性为95.8%. 该方法操作简单、快速,可实现床旁检测 (point-of-care testing, POCT),能应用于RA的早期诊断.     

番茄环斑病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

目的:研发一种快速、便捷检测番茄环斑病毒(ToRSV)的方法。方法:以荧光纳米颗粒为标记物,采用免疫层析试验方法制备ToRSV荧光纳米颗粒试纸条,在紫外灯下观察试纸条上的荧光信号,作为结果判定依据。结果:用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测包括ToRSV在内的9种病毒,仅ToRSV有阳性反应,其余待测样品均呈阴性,表明该试纸条具有较好的特异性;用该荧光试纸条与传统胶体金试纸条进行灵敏度测试时,其灵敏性高于胶体金试纸条1倍以上,且稳定性试验结果良好。结论:ToRSV荧光纳米颗粒试纸条的研制,为快速检测ToRSV提供了有效手段,该方法可用于现场检验,具有广阔的应用前景。     

实验用小型猪呼吸道支原体检测及方法比较

目的通过常用的三种不同方法对支原体的检测,了解实验用小型猪支原体感染情况,为今后实验用小型猪支原体检测方法国家标准的制定提供参考。方法采用培养法、PCR和ELISA方法分别对20头小型猪的气管、肺和血清进行检测。结果三种检测方法中,PCR方法支原体阳性检出率为15%,ELISA方法为20%,而培养法结果均为阴性。结论目前在普通级小型猪中存在支原体的感染。检测方法中PCR和ELISA方法较培养法更省时,敏感性更高。     

用PCR检测细胞培养中支原体污染

细胞培养中支原体污染已经成为严重的问题.为了扩增6种支原体(精氨酸支原体,口腔支原体,人型支原体,猪鼻支原体,发酵支原体及莱氏支原体)核糖体RNA操纵子的16s和23s DNA间区,设计了三个通用PCR引物(F1,F2及R1).当以6种支原体DNA为模板时,引物F1和R1产生340到468bp的片段,引物F2和R1产生145到211bp的片段,当用Hela细胞或E.coli DNA作为模板,用引物F1和R1时,在电泳中未观察到特定区带.此法最小能检出8.5fg精氨酸支原体DNA,相当于13个精氨酸支原体.这说明,当这些支原体污染细胞培养时,能用PCR法检测出来.     

核酸试纸条检测方法研究进展*

凝胶电泳、实时荧光PCR等常规核酸检测方法存在操作繁琐、设备昂贵、反应时间长等局限性。随着核酸检测市场规模的大幅提升,常规检测方法已无法满足临床诊断、检验检疫的需求。核酸试纸条(nucleic acid detection strip,NADS)是一种新兴的核酸检测方法,具有灵敏度高、操作便捷、结果可视化、成本低且耗时短等优势,在基础研究与临床诊断等领域受到广泛关注。综述近年来NADS的检测方法及研究进展,系统总结该技术的原理、应用及临床潜在转化价值,以期为NADS的进一步开发、利用提供借鉴。     

一种快速判定细胞培养中支原体污染的方法——瓜氨酸测定法

目的：开发一种简便、快速、能及时发现细胞培养中支原体污染的方法。方法：用HPLC检测细胞培养中瓜氨酸是否存在及其量的大小。结果：当细胞培养被支原体污染时,培养基中精氨酸量明显下降,同时有瓜氨酸出现;当支原体被消除后,瓜氨酸即消失。结论：在细胞培养中瓜氨酸的出现与支原体污染的关系是特异的,用HPLC在2h内即可检出,表明该方法可靠、简便、快速,可作为细胞培养过程中支原体污染的常规监测手段。     

猪肺炎支原体P97基因随机肽库的构建

目的:构建能用于抗原表位筛选的猪肺炎支原体(Mhp)P97基因C-端序列噬菌体随机肽库.方法: 以Mhp Z株(强毒)基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得Mhp P97基因的C-端部分序列,扩增产物用DNaseⅠ消化并回收50 bp～100 bp的随机片段,将回收的随机片段插入pC89pⅧ型噬菌粒载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue,辅助噬菌体VCSM13超感染,使P97基因随机片段以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面, 从而成功构建了P97基因特异性噬菌体随机肽库.用PCR及DNA测序法鉴定所建文库的随机性和多样性,测定肽库的滴度并计算库容量.结果: 所建肽库的容量约为1.8×104,滴度约为1.3×1012 TU/mL,PCR检测及DNA测序结果显示插入片段具有随机性和多样性.结论: 所建随机肽库具有较好的随机性和多样性,能够满足后续的抗原表位筛选,为进一步的深入研究奠定了基础.     

应用蛋白截短技术检测APC基因胚系突变

建立蛋白截短检测技术,分析家族性腺瘤样息肉病（FAP）发病相关基因APC基因的胚系突变,研究基因突变型与FAP疾病表型的关系。经临床诊断的22例FAP患者及43例散发性大肠癌患者,分别取外周静脉血和正常结肠粘膜组织,常规提取基因组DNA。应用蛋白截短检测技术,分段分析APC基因巨大的第15外显子,对检出截短蛋白的样本进行测序,以确定突变位点及突变性质。22例FAP患者中,5例患者存在APC基因第15外显子的胚系突变,均为碱基缺失造成的移码突变,导致截短蛋白的产生;43例散发性大肠癌患者中未检测到APC基因第15外显子的胚系突变。蛋白截短检测技术是一种高效的基因突变分析技术,适用于大片段基因（如APC基因第15外显子）截短型突变的检测,可作为FAP症状出现前的常规基因诊断技术的一项有效补充。     

急性肺炎支原体肺炎儿童CRP和D-二聚体检测的临床意义

探讨急性肺炎支原体肺炎患儿CRP和D-二聚体水平的变化及临床意义。采用速率散射比浊法和Liatest免疫法,分别检测急性肺炎支原体肺炎患儿96例、细菌性肺炎患儿123例及对照组60例血清CRP水平和血浆D-二聚体水平。实验结果显示,急性肺炎支原体肺炎患儿、细菌性肺炎患儿血清CRP水平和血浆D-二聚体水平均明显高于对照组。CRP和D-二聚体可以作为急性肺炎支原体肺炎患儿体内炎症反应和血液高凝状态的检测指标。