NKT细胞发育过程中microRNA表达谱变化

目的：探讨自然杀伤性T细胞（NKT）发育、成熟过程中microRNA表达谱变化。方法：采用流式细胞仪分选小鼠胸腺不同发育阶段NKT细胞,提取细胞总RNA,经反转录和预扩增后利用TaqMan低密度microRNA表达谱分析阵列检测NKT发育、成熟过程中发生表达变化的microRNAs,并采用real-time PCR进一步验证。结果：NKT细胞发育、成熟过程中,共有92个microRNAs表达发生显著变化。表达显著增加的microRNAs有71个,其中有36个表达持续增加;而表达显著降低的microRNAs有21个,其中有12个表达持续降低。选取Let-7f、miR 150、miR-155、miR-223、miR-24和miR-29进行real-time PCR,发现Let-7f、miR-150、miR-24、miR-29在NKT细胞发育、成熟过程中表达增加,而miR-223和miR-155表达降低,其表达变化趋势与表达谱分析一致。结论：NKT细胞发育、成熟过程中伴随大量特异microRNAs的不同表达变化,提示特异microRNA调控NKT细胞的发育和功能。     

miR-126基因敲减对小鼠胸腺淋巴细胞发育的影响

目的研究miR-126基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响,并初步探讨其意义。方法观察miR-126基因敲减(KD)小鼠胸腺的体积、重量和细胞总数;Real-time PCR检测小鼠胸腺miR-126表达水平;HE染色观察小鼠胸腺形态学结构;FACS检测胸腺中淋巴细胞比例、核抗原Ki-67的表达以及细胞凋亡的变化;最后,Western blot检测胸腺中磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化ERK1/2(p-ERK)的表达。结果 WT和miR-126KD小鼠胸腺体积大小、重量以及细胞总数均无明显差异,但miR-126KD小鼠胸腺miRNA-126表达水平显著下调(P0.05)。miR-126KD小鼠胸腺组织结构出现形态学异常。与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞比例及细胞绝对数明显增加(P0.05),而CD4~+CD8~+(DP)细胞比例及绝对数则显著减少(P0.05),miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞核抗原Ki-67表达显著增加(P0.05),且细胞凋亡明显减少(P0.05),而DP细胞Ki-67表达则明显减少(P0.05)。最后,miR-126KD小鼠胸腺淋巴细胞中磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2的表达水平明显下调(P0.05)。结论 miR-126基因敲减可显著影响胸腺细胞特别是CD4~+SP细胞的发育,为后续进一步深入探讨miR-126对T淋巴细胞发育以及功能的影响提供重要的实验基础。     

miR-150缺失增强小鼠NKT细胞IFN-γ产生并促进小鼠Ⅰ型糖尿病的发生

目的:探讨miR-150在小鼠NKT细胞免疫功能中的作用及对小鼠Ⅰ型糖尿病发生的影响.方法:采用miR-150基因敲除小鼠;流式细胞术检测小鼠外周免疫器官NKT细胞数量变化;细胞内染色和ELISA检测NKT细胞因子的表达和分泌;采用STZ处理建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型,体内注射α-Galcer活化NKT细胞,观察miR-150敲除对小鼠糖尿病发生的影响.结果:miR-150基因缺失不影响小鼠外周NKT细胞的数量,但导致NKT细胞IFN-γ产生显著增加;采用STZ处理小鼠并同时给予α-Galcer活化NKT细胞,发现miR-150敲除加速小鼠糖尿病的发生.结论:miR-150基因敲除促进小鼠NKT细胞IFN-γ的产生,活化miR-150敲除NKT细胞加速小鼠Ⅰ型糖尿病的发生.     

乳香提取物促进免疫低下小鼠模型胸腺前体T细胞分化机制的研究

采用环磷酰胺制备免疫低下小鼠模型,探索乳香提取物提高免疫低下小鼠胸腺前体T细胞数量、增殖及上调Th1和Th2细胞因子产生的作用机制。采用灌胃给小鼠口服乳香提取物。灌胃后取小鼠外周血和胸腺细胞悬液,用特异性抗体染色并经FACS观测小鼠上述细胞数量变化。采用胸腺细胞培养法检测胸腺基质细胞对于前体T细胞分化成熟的支持作用;采用实时定量PCR方法分析乳香提取物促进Th1细胞分化的可能机制。结果表明,乳香提取物具有明显上调小鼠胸腺内未成熟T细胞数量;促进胸腺基质细胞生长及对T细胞分化成熟的支持作用;T细胞发育相关基因表达格局表明灌胃组小鼠胸腺中细胞因子IL-2、IL-6和IL-1基因表达量较对照组高,转录因子T-bet和gata3表达量也增高。进一步分析表明Notch1和其配体DLL1的基因表达量增加。结果提示乳香提取物上调小鼠Th1/Th2细胞亚群可能是通过介导North1/DLL1信号途径而促进胸腺内T细胞分化与成熟。     

异种胸腺移植：受者细胞免疫力重建

胎猪或新出生猪胸腺移植物可以在T细胞剔除的去胸腺小鼠中长期存活，并支持小鼠T细胞的正常发育分化，可使受者外周重新建立受者T细胞池。在异种猪胸腺成熟的小鼠T细胞具有正常的细胞免疫力，且受小鼠自身MHC的限制性。因此，异种胸腺移植可能为AIDS晚期患者或其他由于胸腺功能障碍引起的免疫缺陷性疾病等提供新的治疗手段或具有一定的辅助治疗作用。     

异种胸腺移植:受者细胞免疫力重建

胎猪或新出生猪胸腺移植物可以在T细胞剔除的去胸腺小鼠中长期存活,并支持小鼠T细胞的正常发育分化,可使受者外周重新建立受者T细胞池。在异种猪胸腺成熟的小鼠T细胞具有正常的细胞免疫力,且受小鼠自身MHC的限制性。因此,异种胸腺移植可能为AIDS晚期患者或其他由于胸腺功能障碍引起的免疫缺陷性疾病等提供新的治疗手段或具有一定的辅助治疗作用。     

PLZF调控小鼠早期T细胞发育和自我更新的功能

目的：研究PLZF调控小鼠早期T细胞发育与自我更新的功能，以及PLZF对胸腺细胞发育和自我更新的影响。方法：利用新生小鼠进行胸腺移植，以Rag2/γc^-/-小鼠为受体。首先比较PLZF^-/-与野生型(PLZF^+/+)小鼠胸腺细胞总数的差异，再通过流式细胞术和细胞分选，筛选小鼠的骨髓造血干细胞和胸腺的DN2a细胞以及PLZF^-/-小鼠的早期T细胞系前体(ETP)，以及PLZF^-/-或野生型小鼠在新生小鼠胸腺移植模型的移植物DN1细胞中的表达情况。结果：PLZF^-/-小鼠的胸腺细胞总数和早期T细胞系前体数目与野生型小鼠相比显著下降，并且细胞总数的减少不是由细胞内源性引起的。通过研究PLZF-EGFP报告基因小鼠和新生小鼠胸腺的肾移植模型，发现PLZF在Rag2/γc^-/-受体小鼠胸腺移植物的DN1(Lineage^-CD44⁺CD25^-)细胞中高表达，且供体细胞的PLZF缺失...     

NOD／LtJ小鼠不同发病阶段iNKT细胞频率及亚群变化分析研究北大核心CSCD

目的通过对NOD/LtJ小鼠在未发病、发病初期与发病末期不同组织器官中CD4＋T细胞、CD8＋T细胞、恒定自然杀伤T（iNKT）细胞频率及亚群进行观察分析,进一步了解NOD/LtJ小鼠不同发病阶段免疫功能状态。方法选用雌性NOD/LtJ小鼠为实验对象。血糖仪检测小鼠空腹血糖值,根据尿糖阳性且连续两次≥11.1 mmol/L作为1型糖尿病（T1D）发病标准。实验将动物分为未发病组、发病初期组、发病末期组。记录各组小鼠摄食量和饮水量、尿糖、体重、精神状态、被毛颜色、排尿量等;流式细胞术（FACS）检测各组小鼠外周血、胸腺、脾脏、肝脏、腹股沟淋巴结中CD4＋T细胞、CD8＋T细胞、iNKT细胞频率及亚群比例。结果（1）与未发病和发病初期组比较,发病末期组小鼠精神萎靡,毛发粗糙,饮水量、进食量和排尿量增加,体重降低,胸腺指数、脾脏指数均下降,脾脏、肝脏、胸腺淋巴细胞绝对计数均显著降低（P〈0.05）。（2）与未发病组比较,发病初期组CD4＋T细胞频率在脾脏、肝脏、胸腺、腹股沟淋巴结中均显著增加（P〈0.05）;与发病初期组比较,发病末期CD4＋T细胞频率肝脏、胸腺、腹股沟淋巴结及外周血中均显著降低（P〈0.05）;与未发病组比较,发病初期组CD8＋T细胞频率在脾脏、胸腺中显著增加,在腹股沟淋巴结中显著降低（P〈0.05）,与发病初期组比较,发病末期组CD8＋T细胞频率在肝脏、胸腺中均显著降低,在腹股沟淋巴结中显著增加（P〈0.05）。（3）与未发病组比较,发病初期组肝脏、腹股沟淋巴结中iNKT细胞频率均显著增高（P〈0.05）;与发病初期组比较,发病末期组外周血、肝脏中iNKT细胞频率显著降低（P〈0.05）;脾脏、胸腺iNKT细胞频率3组两两比较差异无统计学意义（P〉0.05）。（4）iNKT1/iNKT2亚群比例：与未发病组比较,发病初期组和发病末期组胸腺iNKT1亚群比例均显著增加,iNKT2亚群比例均显著降低（P〈0.05）,脾脏、肝脏、腹股沟淋巴结iNKT1及iNKT2亚群比例3组两两比较差异无统计学意义（P〉0.05）。（5）与iNKT1亚群比较,iNKT2亚群在3组小鼠的脾脏、肝脏、腹股沟淋巴结中均显著降低（P〈0.05）,在未发病组胸腺中,与iNKT1亚群比例比较,iNKT2亚群比例显著增高（P〈0.05）。（6）与未发病组和发病末期组比较,发病初期组IFN-γ、IL-4、IL-17A水平均显著升高,IFN-γ/IL-4的比值显著升高（P〈0.05）;与未发病组和发病初期组比较,发病末期组IL-6水平显著升高（P〈0.05）。与未发病组比较,发病初期和发病末期IL-10水平增高,且发病末期增高更加显著（P〈0.05）。IL-2水平3组两两比较均无显著性差异（P〉0.05）。结论NOD/LtJ小鼠发病初期iNKT细胞频率的增加以及胸腺iNKT1亚群比例的显著增高可能参与了Ⅰ型糖尿病的发生。     

微小RNA-7敲减对小鼠脾脏中T淋巴细胞体外功能的影响

观察微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(Knock down,KD)对小鼠脾脏T淋巴细胞体外功能的影响并探讨其意义。常规分离野生型(wild type,WT)小鼠脾脏T淋巴细胞,经CD3和CD28抗体刺激后,Real-time PCR检测不同时间点(0h;24h;48h)细胞中miR-7的表达变化;进一步用Con A、CD3和CD28抗体刺激miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞,CCK8检测细胞增殖率;Real-time PCR检测miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10表达的变化;FACS检测CD4+T和CD8+T细胞的数量变化及CD4+T细胞膜分子CD44、CD62L和IL-4、IFN-γ的表达变化。结果显示,WT小鼠脾脏T淋巴细胞活化后,miR-7的表达水平显著上调(P0.05);与WT小鼠相比,在Con A、CD3和CD28抗体作用下miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显增加(P0.05);miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均明显上调(P0.05),而IL-10表达显著下调(P0.05);FACS检测结果显示CD4+T细胞比例明显上调(P0.05),而CD8+T细胞的比例变化不显著(P0.05);CD4+T细胞膜分子CD62L水平显著下降,CD69及IL-4、IFN-γ的表达水平均显著上调(P0.05)。结果表明,miR-7敲减以后可显著影响小鼠脾脏T淋巴细胞的功能,本实验为后续深入探讨其在T淋巴细胞功能调控中的作用提供实验依据。     

miR-195过表达促进人神经胶质瘤细胞T98G凋亡

目的检测过表达miR-195对人神经胶质瘤细胞T98G增殖的影响,探讨miRNA-195在胶质瘤发病过程中可能机制。方法用合成的miR-195模拟物,转染miR-195表达水平较低的人神经胶质瘤细胞T98G,用MTT、流式细胞术和TUNEL法分别检测T98G细胞增殖、细胞周期和凋亡,用Western blot检测细胞BCL-2的表达。结果 miR-195模拟物转染T98G后,成熟miR-195明显升高(P<0.05)。在T98G中过表达miR-195后,可明显抑制细胞增殖,过表达miR-195能促进T98G细胞的凋亡和下调细胞BCL-2的表达。结论过表达miR-195能显著促进T98G细胞凋亡,提示miR-195可能对胶质瘤的治疗起作用。