拟南芥Patellin2相互作用蛋白的筛选及鉴定

Patellin 2(PATL2)蛋白是具有SEC14蛋白结构域的脂质转移蛋白,定位于细胞分裂后期的细胞板上,在细胞分裂过程中发挥重要的作用.同时,PATL2蛋白还受到植物激素和环境变化的调控,说明PATL2可能在植物激素和环境变化的调控下参与细胞分裂过程.为了深入了解PATL2蛋白的生物学功能,研究PATL2蛋白发挥作用的分子生物学机制,我们分析了它在植物体内的表达特点和与之相互作用的蛋白.我们通过免疫共沉淀与液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析了过表达PATL2的转基因植株,并获得了多个可能与PATL2相互作用的蛋白,其中一个是细胞周期蛋白依赖性激酶CDKB2;2.通过观察PATL2启动子驱动的GUS报告基因在植物中的表达,发现PATL2基因在叶片、花瓣、花粉中广泛表达,但在角果中的表达非常有限,仅存在于角果的两端,这与已报道的CDKB2;2的组织分布部分相同.同时,烟草叶表皮细胞瞬时表达结果表明PATL2和CDKB2;2能够共定位于烟草叶表皮细胞的细胞膜和细胞质中.体外pull-down实验和双分子荧光互补实验(BiFC)实验分别确定了PATL2和CDKB2;2在植物体外和植物体内的相互作用.     

水稻MRG701互作蛋白的筛选和鉴定

水稻MRG蛋白MRG702作为组蛋白H3K4/H3K36甲基化的识别蛋白,影响了水稻油菜素内酯BR通路和开花过程中特异的基因表达.MRG蛋白家族的另外一个成员MRG701在序列上与MRG702高度同源,它们的共同缺失突变体表现出矮小、直立、晚花等多种表型.以MRG701为饵,筛选了水稻全长均一化酵母文库,得到了26个可能与MRG701结合的蛋白质,通过定位分析,这些蛋白主要定位于细胞核和线粒体中,在二者中的分布比例分别为46.2%和23.1%.通过酵母双杂交实验和双分子免疫荧光实验,对全部得到的26个蛋白和其中4个蛋白与MRG701蛋白的相互作用进行了验证,发现Os10g0410600,Os05g0215800,Os04g0687100和MRG701在烟草中存在相互作用,为进一步研究甲基化识别蛋白的作用机制及作用网络提供了基础.     

棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白Gh GAI2b基因,构建p BP35S:Gh GAI2b和p BP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白Gh GAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白Gh GAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。     

果蝇微管互作蛋白的大规模筛选研究

微管是一种具有极性的、管状的细胞内动态结构,是细胞骨架的重要组分.一些跟微管相关的基因发生突变时,有可能致使严重的人类疾病的发生.这些相关基因编码的蛋白即为微管互作蛋白.影响微管的基因众多,目前发现的影响微管正常组装的蛋白还只是冰山一角,仍有诸多影响微管的互作蛋白等待人类“挖掘”.我们利用已有的果蝇RNAi文库,通过UAS/Gal4系统,对部分基因进行敲减(RNAi),使基因在果蝇幼虫肌肉中特异性沉默,经过免疫染色后观察这些基因功能敲降果蝇的肌肉微管形态,以此来筛选微管互作蛋白.我们共鉴定了541个基因,筛选出微管有表型的40个.其中一些基因在线粒体、内质网、高尔基体、过氧化物酶体等细胞器中具有特定的功能.因此,我们的筛选工作不仅为构建微管相关疾病模型提供了铺垫,为微管相关疾病治疗工作提供了一定的帮助;而且对细胞结构中微管的非中心体微管组织中心探究提供了思路.     

羊布鲁菌外膜蛋白OMP2b的克隆，原核表达及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白 OMP2b 基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌 M5株外膜蛋白 OMP2b 蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1130bp 的目的基因片断,克隆入融合表达载体 pGEX-4T-1,构建重组质粒 pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用 Western-blot 分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了 omp2b 基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌 OMP2b 蛋白。本研究成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的 OMP2b 蛋白具有良好的免疫原性。     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

新的STK11互作蛋白LOH12CR1的筛选及鉴定

PJ综合征（Peutz-Jeghers syndrome,PJS）的疾病基因STK11编码由433个氨基酸残基组成的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶STK11,具有调控细胞周期,调节细胞极性以及细胞基础能量代谢等重要功能．STK11蛋白羧基端含有123个残基,对STK11生物学功能的实现起着调节作用,但机制尚未明确．本研究利用pGEX4T-2原核表达系统,构建pGEX4T-2-STK11羧基端重组载体,并诱导表达了GST—STK11羧基端融合蛋白,采用GST—pull down结合质谱分析的方法,鉴定出STK11羧基端的可能互作蛋白LOH12CR1．通过免疫共沉淀技术证实了STK11激酶同LOH12CR1互作;免疫荧光共定位实验亦发现STK11与LOH12CR1共定位．STK11与LOH12CR1互作的发现为研究STK11的功能提供新的切入点．     

基于复合物信息和亚细胞定位信息的关键蛋白质识别

针对蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络中存在大量噪声,以及现有关键蛋白识别方法的挖掘效率和预测准确率不高等问题,提出一种基于复合物信息和亚细胞定位信息(united protein complexes and subcellular locallizations,PCSL)来识别关键蛋白质。首先,整合PPI网络的拓扑属性、生物属性和空间属性构建加权网络,以降低PPI网络中噪声的影响,达到提升PPI网络的可靠性的目的;其次,根据复合物信息和空间信息,设计一种衡量蛋白质关键性的度量,从多维角度强化关键蛋白质在PPI中的重要程度;最后,利用基于PPI网络拓扑特性的寻优算法,设计一种新的试探策略,提升挖掘关键蛋白质的效率。PCSL方法应用在DIP(database of interacting protein)数据集上进行验证。实验结果表明,与其他10种关键蛋白质识别方法相比较,该方法具有较好的识别性能,能够识别更多的关键蛋白质。     

两个稻瘟病菌假想蛋白的纯化和特性分析

稻瘟病菌(Magnaporthe Grisea)引起的水稻稻瘟病是世界水稻生产最具毁灭性的病害之一,也是研究植物与病原物相互作用分子机理的模式系统之一.真菌分泌蛋白由于其本身所具有的分泌特性极有可能成为被宿主植物识别的作用病菌分泌蛋白,该研究到目前为止还比较有限. 文章证明了稻瘟病菌分泌蛋白的存在并且检验了其中几个蛋白在其宿主植物水稻中的诱导因子作用. 通过同源基因的时空表达技术,表明分泌蛋白在稻瘟病菌中大量表达.其中两个在稻瘟病菌中的未知蛋白被测试出具有诱导因子作用.     

CLN8P相互作用蛋白靶基因的获取与初步鉴定

为了获得CLN8P相互作用蛋白靶基因并对其进行初步鉴定,实验经抽提酵母质粒DNA,电转化大肠杆菌,选择性培养基分离质粒,酶切鉴定、测序、生物信息学分析,结果获得了CLN8P相互作用蛋白阳性克隆的一个靶基因BAG5;利用酵母双杂交共转化法初步验证,表明BAG5蛋白与CLN8P具有相互作用,并可能因此影响到神经细胞的正常生长.这将有利于进一步深入研究CLN8的功能及阐明NCLs发病机制.     

改性聚苯乙烯微球对蛋白质的吸附与解吸特性

通过蒸馏–沉淀法制备单分散的聚苯乙烯(PS)微球,并用两亲性聚合物聚乙二醇(PEG)对PS进行修饰.以牛血清蛋白(BSA)为模型,研究PS-PEG微球对BSA的吸附与解吸特性.结果表明,聚合物微球对BSA的吸附受pH、微球上PEG含量以及NaCl溶液质量浓度的影响,作用力为疏水吸附.在无盐水体系下解吸,解吸率最高为96.2%,表明微球在蛋白质分离应用中可重复使用.     

髓母细胞瘤中P53、bcl-2及Ki-67的表达及其意义

用免疫组化S P法检测 2 5例髓母细胞瘤中Ki 6 7、P53 及bcl 2基因的表达。结果表明 ,在 2 5例髓母细胞瘤中 ,bcl 2和P53 蛋白的阳性表达率分别为 72 % (18/ 2 5 )和 16 % (4/ 2 5 )。Ki 6 7阳性率平均为 (33.34± 4 .98) % ,其表达与组织学分型有关。说明在髓母细胞瘤中bcl 2蛋白与P53 蛋白可能参与调控细胞的凋亡     

Structure Characterization of the Folding Intermediates of Proteins

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｍａｌｌｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓｕｓｕａｌｌｙｕｎｆｏｌｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙｂｙａｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｗｈｉｃｈｐａｒｔｉａｌｌｙ ｆｏｌｄｅｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｕｌｌｙｆｏｌｄｅｄ ,ｎａｔｉｖｅｓｔａｔｅａｎｄｔｈｅｆｕｌｌｙｕｎｆｏｌｄｅｄｓｔａｔｅａｒｅｎｏｔｓｔａｂｌｅａｔｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ .Ｕｎｄｅｒ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ,ｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｖｅｃｏｎｆｏｒ…     

平衡透析法用于有机小分子和蛋白质相互作用研究进展

生物大分子是近年来生命科学研究的热点和难点之一,有关蛋白质的各类研究也是人们比较感兴趣的课题.平衡透析法是定量研究蛋白质与有机小分子相互作用的经典方法.通过平衡透析法的研究我们可以讨论蛋白质与有机小分子的结合数目、结合平衡常数及作用力情况等.近年来,国内外学者在此方面做了大量的工作,提出了各种各样的结合模型.本文就此方面的研究进行综述.     

几种鱼肌肉蛋白的电泳分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对鲤鱼、草鱼、白鲫鱼、鲢鱼、罗非鱼及鲨鱼的肌肉蛋白做鉴别分析．实验采用4种不同抽提液对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白进行提取．肌肉蛋白经电泳后以银染色或考马斯亮蓝染色并对蛋白质图谱作对比分析．根据蛋白质条带的数量、迁移率及浓度等特点,得出各鱼种间的相似性及差异性．结果表明,以SDS-PAGE电泳法可实现对水产食品原料品种的初步鉴别．     

液泡前体蛋白质的双向电泳分离和质谱分析

该文通过改进双向电泳方法克服了膜蛋白由于有疏水性而很难进入双向电泳第一相——等电聚焦电泳凝胶,以及由于从蔗糖密度梯度离心中分离得到的液泡前体富含干扰等电聚焦电泳效果的蔗糖等两大难点,成功地分离了通过蔗糖密度梯度离心分离得到的液泡前体蛋白,并使膜蛋白进入了双向电泳凝胶.双向电泳后分离到约200余个蛋白质点,用基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MS/MS)进行肽质量指纹谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定与功能预测,分析的23个蛋白中有13个在数据库中没有找到相对应的吻合蛋白,查询到的10个吻合蛋白中有6个功能未知.