UVB致成纤维细胞损伤及两种中药的保护作用研究

目的观察中波紫外线(UVB)辐射后成纤维细胞(FB)DNA光产物环丁烷嘧啶二聚体(CPD s)产生和清除情况及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和黄芩甙的干预作用。方法以30,60,90 m J/cm2UVB照射FB并予EGCG及黄芩甙干预处理,采用免疫细胞化学法在照光后不同时间检测CPD s的产生和清除情况。结果细胞损伤程度随照光剂量加大而加重;30 m J/cm2UVB照射后细胞CPD s生成量在辐射后1 h左右达到高峰,同时细胞也开始清除CP-D s,辐射后4 h内清除速率较快,4 h后清除速率逐渐降低,至24 h基本清除CPD s;EGCG和黄芩甙处理UVB辐射的细胞CPD s少于单纯照光组(P<0.05)。结论UVB辐射可以导致FB的DNA损伤而产生光产物CPD s;细胞损伤程度显示剂量依赖性;细胞自身有修复能力;EGCG和黄芩甙均可降低UVB辐射所致的光产物水平。     

羟氯喹及没食子酸酯对HaCaT细胞光照射的影响

目的 探讨羟氯喹和绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)损伤永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)的保护作用及其机制。方法 采用UVB定时及定量照射培养的HaCaT细胞,分别加入羟氯喹和EGCG干预处理,以RT-PCR法检测各受试组p53、p21、c-fos基因表达水平。结果 UVB照射后可明显增加HaCaT细胞中p53,p21,c-fos mRNA表达,羟氯喹和EGCG可不同程度地下调上述基因表达水平。结论 羟氯喹和EGCG的光保护作用在HaCaT细胞可能与其抑制p53,p21,c-fos基因表达有关。     

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

中波紫外线激活HaCaT细胞炎症信号通路的实验研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)对角质形成细胞(KC)炎症信号通路的影响.方法 UVB(40 mJ/cm²)照射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,分别于照射后0、10、30、60、120、240min收集细胞蛋白和核蛋白,蛋白质印迹法检测NF-κB信号传导通路中的重要分子-磷酸化IκB-α(P-IκB-α)、IκB-α和NF-κB p65蛋白的动态变化,以及MAPK家族的蛋白分子ERK1/2、p38、c-JNK等磷酸化激活的动态变化.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,UVB照射后0.5h IκB-α开始发生磷酸化和降解,在第2、4小时时更加明显;细胞核蛋白p65的量在照射后0.5h开始升高,在随后的2h时达到高峰.UVB照射后10 min HaCaT细胞内的ERK1/2、p38、c-JNK蛋白的磷酸化就开始增加.结论 UVB照射KC可激活细胞内的NF-κB及MAPK信号传导通路.     

UVA对成纤维细胞和HaCaT细胞形态及诱导型一氧化氮合酶产生水平的影响

目的 比较5 J/cm²长波紫外线(UVA)照射对人皮肤成纤维细胞和HaCaT细胞形态、数目和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生的影响.方法 5 J/cm² UVA分别照射人成纤维细胞和HaCaT细胞后24 h,48 h和72 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态和数目变化,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞免疫组化方法检测两种细胞iNOS mRNA和蛋白表达的情况.结果 人成纤维细胞在照射后3个时间点细胞均出现皱缩,24 h细胞数目即明显低于照射前(P<0.05),iNOS mRNA和蛋白在照射后24 h有高峰表达;HaCaT细胞在3个时间点细胞形态未见明显改变,细胞数目在照射后48 h才明显低于照射前(P<0.05),且iNOS mRNA和蛋白在照射后48 h有高峰表达.结论 5 J/cm² UVA照射后人成纤维细胞比HaCaT细胞更易受到损伤,iNOS高峰表达出现更早,且持续时间更长.     

中波紫外线辐射剂量与HaCaT细胞凋亡时相的相关性研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射角质形成细胞后,UVB辐射剂量与角质形成细胞凋亡时相的相关性。方法 以20,40,60,80,100和120mJ/cm²的UVB辐射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,检测辐射后2,12,24,48和72h的细胞活性和细胞周期的变化,以及代表不同时相的凋亡通路:即应用广谱Caspase抑制剂VAD-FMK与凋亡细胞中活化的Caspase不可逆的结合检测早期Caspase介导的凋亡;应用AnnexinV及PI双染方法检测后发的细胞膜介导的凋亡;以及应用DNA的梯度凝胶电泳检测晚期细胞核介导的凋亡。结果 UVB辐射可使HaCaT细胞的细胞周期受滞于G2/M期,G2/M期的百分比与辐射剂量成正比。细胞活性于24h后与辐射剂量成反比。各时相的凋亡率均与辐射剂量成正比,但凋亡通路有明显的时相性:即早期(48h内)由Caspase和细胞膜介导凋亡为主,晚期(48h后)则由细胞核介导凋亡为主。结论 UVB诱导的角质形成细胞凋亡具有显著的剂量与时相依赖性特征。宜对其进行多指标、多时相的检测。     

黄芩苷对中波紫外线所致HaCaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、原癌基因c-myc蛋白表达的影响

目的:观察中波紫外线(UVB)辐射引起的人表皮角质形成细胞株HacaT细胞凋亡、细胞周期及p16、c-myc蛋白水平的影响及传统中药黄芩苷(baicalin)对它的干预作用.方法:以200 mg/L黄芩苷预处理HacaT细胞,以流式细胞仪检测经0、30、60和90 mJ/cm2的UVB照射后24 h细胞周期和凋亡率变化;以Western blot方法检测90 mJ/cm2 UVB照射后p16、c-myc 蛋白的表达水平.结果:UVB照射可诱导HaCaT细胞产生凋亡,凋亡率呈剂量依赖性增加;30 mJ/cm2 剂量下细胞可出现明显S期阻滞,随UVB剂量增大,S期细胞数量相对下降;照光后p16、c-myc蛋白水平均有所增高.加入黄芩苷处理可抑制UVB引起的上述变化.结论:黄芩苷可明显抑制UVB引起的凋亡与细胞周期阻滞以及p16、c-myc蛋白表达,证实该药具有有效的光保护作用.     

芦荟甙对中波紫外线辐射HaCaT细胞表达诱导型一氧化氮合酶及核因子κB的影响

目的 探讨芦荟甙对中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞诱导核因子kB(NF-KB)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的抑制作用。方法 采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖变化,生化比色法检测培养细胞上清液中NO含量,RT-PCR法检测HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达变化,免疫荧光细胞化学染色测定NF-kB P65的激活表达。结果 30 mJ/cm² UVB辐射HaCaT细胞,细胞的增殖明显下降,NO的合成分泌增加,iNOS mRNA表达显著增加,同时NF-kB被激活,从细胞浆易位到细胞核。芦荟甙对HaCaT细胞的增殖有显著促进作用。用不同浓度芦荟甙预处理HaCaT细胞,可以显著抑制UVB辐射诱导的NF-kB激活,下调iNOS mRNA表达及NO合成分泌。经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 芦荟甙通过抑制UVB辐射诱导的NF-kB P65激活,下调iNOS mRNA表达,减少NO合成分泌,发挥防护紫外线辐射损伤的作用,在炎症性皮肤病防治中可能发挥重要作用。     

黄芩苷对中波紫外线诱导后BALB/c小鼠表皮光产物形成的干预作用

目的 观察中波紫外线（UVB）诱导BALB/c小鼠皮肤表皮细胞光产物的形成和清除情况,以及黄芩苷的干预作用。方法 将黄芩苷（1 mg/cm2）连续3 d外用于BALB/c小鼠表皮24 h后,采用免疫组织化学法及免疫印迹法检测180 mJ/cm2 UVB辐射后1 h、24 h和48 h小鼠表皮内环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的产生和清除情况。结果 CPD仅在接受UVB辐射的小鼠皮肤内出现。相对于UVB辐射后1 h光产物的平均值,UVB辐射组1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（100 ± 5.22）％、（75.34 ± 8.22）％和（42.11 ± 3.24）％;经过黄芩苷处理后的小鼠接受UVB辐射后1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（81.45 ± 5.22）%、（32.14 ± 6.33）%和（5.21 ± 3.15）%;而丙酮处理后的小鼠接受UVB辐射后1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（106 ± 8.21）%、（70.23 ± 4.13）%和（41.22 ± 4.21）%。结论 外用黄芩苷能抑制UVB辐射诱导光产物的形成,并在48 h内加速光产物的清除。黄芩苷是一种有效的紫外线防护剂。     

表没食子儿茶素没食子酸酯减轻UVB诱导的朗格汉斯细胞凋亡作用

目的 研究中波紫外线(UVB)对人表皮朗格汉斯细胞(LC)的光损伤作用以及绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的光保护作用。方法 采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化人表皮LC,将分离纯化的LC随机分为对照组、30 mJ/cm² UVB辐射组以及辐射后加用200μg/mL EGCG处理组,4h后以PI染色并经流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 30 mJ/cm² UVB辐射组的凋亡率明显高于对照组,EGCG干预组的凋亡率低于单纯UVB辐射组,但仍高于非照射对照组;且辐射后S期细胞数明显增加。几乎没有G₂/M期的细胞,EGCG处理辐射细胞后,S期细胞数减少。结论 UVB可诱导人表皮LC凋亡,而EGCG具有一定的保护作用。     

中波紫外线辐射对原代及永生化角质形成细胞损伤能力的比较研究

目的：观察原代角质形成细胞和永生化HaCaT角质形成细胞对中波紫外线照射的反应差异。方法：采用不同剂量中波紫外线(UVB)照射上述两种细胞，评估UVB对细胞作用的时间及剂量效应，以倒置光学显微镜观察细胞受损程度，MTT法检测细胞活性。结果：UVB照射后，细胞损伤程度均随照射剂量加大而加重；另经24h、48h及72h孵育后，对两种细胞进行不同时间段的细胞活性(MTT)比值比较(72h／24h，72h／48h)：分别为原代角质形成细胞(1．16和1.63)和HaCaT细胞(0．96和0．91)。MTT结果显示低剂量紫外线照射时，细胞损伤恢复可发生在照射后48h；高剂量紫外线照射后，两种细胞的损伤程度均随孵育时间延长而加重。结论：原代角质形成细胞抵抗紫外线照射损伤的能力较强，而HaCaT细胞相对较易受损。     

中波紫外线诱导HaCaT细胞凋亡中TF-1细胞凋亡相关基因19的表达

目的：研究在中波紫外线(UVB）诱导正常永生化角质形成细胞(HaCaT）凋亡过程中，T细胞凋亡相关基因19(TFAR 19）的表达时相及位置，方法：使用流式细胞仪、膜联蛋白V(Annexin—V）、激光扫描共聚焦显微镜等方法进行研究。结果：在凋亡过程中，TFAR 19逐渐向核周聚积，最后向核膜内移位，在核膜及其周围以及核内表达。结论：在UVB诱导HaCaT细胞凋亡的早期和晚期过程中TFAR 19均有表达。     

MiR-23a regulates DNA damage repair and apoptosis in UVB-irradiated HaCaT cells

BackgroundMiRNAs remain at a constant level under physiological conditions. However, how the expression of miRNAs is regulated and what are the roles of miRNAs in response to UVB damage to skin cells is still not fully understood. In our preliminary study, we observed that miR-23a was upregulated following a treatment with a DNA repair agent and UVB exposure.ObjectiveTo investigate the regulation and function of miR-23a in response to UVB-induced injury in human keratinocyte cell line (HaCaT) cells.MethodsThe changes in expression of miR-23a after UVB irradiation of HaCaT cells were measured by qRT-PCR. The level of miR-23a expression was also modulated by transfecting with a miR-23a mimic or an inhibitor. Cell viability was assessed by the CCK-8 assay. Immunofluorescence staining and Southwestern dot blotting were used to detect the levels of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). Flow cytometry, Hoechst staining, and measurements of caspase-3 activity were employed to measure the incidence of apoptosis. The mRNA and protein expression levels of genes related to DNA reparation and apoptosis, such as topoisomerase-1, caspase-7, and STK4, were analyzed by qRT-PCR and Western blotting, respectively.ResultsMiR-23a expression was remarkably up-regulated at 4 h and 24 h after the UVB irradiation of HaCaT cells. UVB-induced apoptosis was increased by down-regulation of miR-23a. UVB-induced removal of CPDs was accelerated by miR-23a up-regulation and delayed by miR-23a down-regulation. Forced over-expression of miR-23a decreased the expression of UVB-induced topoisomerase-1\caspase7\STK4 at both the mRNA and protein levels, and these effects were reversed by down-regulation of miR-23a.ConclusionThe protection of HaCaT cells against UVB damage is afforded by miR-23a through regulation of topoisomerase-1\caspase7\STK4, and this miRNA may be a novel therapeutic target in skin diseases related to UVB radiation.     

不同剂量中波紫外线照射对角质形成细胞增殖活力和自噬体表达影响的研究

【摘要】 目的 观察HaCaT细胞和原代角质形成细胞接受不同剂量中波紫外线（UVB）照射后细胞增殖活力和自噬体表达水平的变化,并初步评估增殖活力损伤程度和自噬体表达水平之间的相关性。 方法 两种细胞各分为5组,对照组、5、10、20、40 mJ/cm2 UVB照射组,照射结束后12 h进行MTT实验或单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色,全波长酶标仪下读取各孔A值,倒置荧光显微镜下随机选取视野,计数每视野下自噬体表达阴性细胞和阳性细胞数目。 结果 经不同剂量UVB照射后,HaCaT细胞的增殖活力（A值）较原代角质形成细胞下降更明显,其中HaCaT细胞10、20、40 mJ/cm2照射组（A值分别为1.367 ± 0.035、1.173 ± 0.034、0.873 ± 0.025）两两之间以及与对照组（1.519 ± 0.022）之间差异均有统计学意义（P < 0.01）;原代角质形成细胞仅10、20、40 mJ/cm2 UVB照射组（A值分别为0.782 ± 0.012、0.773 ± 0.021、0.725 ± 0.031）与对照组（0.887 ± 0.035）之间差异有统计学意义（P < 0.05）。5、10、20 mJ/cm2 UVB照射后两种细胞MDC染色,自噬体表达阳性的细胞比率均出现增加,但照射量至40 mJ/cm2时则出现下降,以原代角质形成细胞下降更明显,其中HaCaT细胞10 mJ/cm2和20 mJ/cm2 UVB照射组自噬体表达阳性率（分别为22.69% ± 2.15%、28.10% ± 2.92%）较对照组（10.18% ± 1.50%）有显著上升,而40 mJ/cm2组自噬体表达上升幅度出现下降（趋势卡方检验χ2 = 27.48,P < 0.01）;原代角质形成细胞对照组、5、10、20 mJ/cm2组间自噬体阳性率变化不大,但40 mJ/cm2组表达出现明显抑制（趋势卡方检验χ2 = 6.86,P < 0.01）。 结论 UVB对HaCaT细胞和原代角质形成细胞增殖活力的损伤均有剂量依赖性,原代角质形成细胞更耐受UVB损伤;5、10、20 mJ/cm2 UVB照射能促进HaCaT细胞自噬体表达增加,且有剂量依赖性,而对原代角质形成细胞自噬体表达水平未产生显著影响;40 mJ/cm2 UVB照射后HaCaT细胞自噬体表达有下降趋势,而显著抑制原代角质形成细胞自噬体水平的表达。 【关键词】 角质形成细胞; 自噬体; 紫外线     

Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的表达

目的探讨Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的作用。方法研究对象为人角质形成细胞HaCaT细胞,实验分为正常对照组、10、20、40、80 m J/cm^2中波紫外线组(UVB)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察增殖能力;流式细胞仅(FCM)实验检测细胞凋亡;实时定量PCR、Western-blot检测细胞内的Survivin、Caspase-3表达水平。结果与正常对照组相比,NB-UVB照射组细胞增殖抑制作用及凋亡明显增强(P<0.05),并随着照射剂量的增加,其细胞凋亡作用增加。同时与正常对照组相比,不同UVB照射剂量组Caspase-3表达均增强,其表达增强程度随着照射剂量的增加而增加,与正常对照组相比,10 m J/cm^2照射组,细胞表达Survivin水平最高(P<0.05),20 m J/cm^2组Survivin表达水平下降,稍低于对照组水平,40、80 m J/cm^2组Survivin进一步下降,较对照组下降明显(P<0.05)。结论 Survivin、Caspase-3参与了UVB诱导HaCaT凋亡细胞。Survivin表达水平与UVB辐射剂量有关。     

姜黄素对紫外线诱导损伤的HaCaT细胞的保护作用

目的比较姜黄素对UVA、UVB急性损伤的HaCaT细胞的保护作用。方法体外培养人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞,UVA、UVB照射建立HaCaT细胞急性光损伤模型。姜黄素与HaCaT细胞共培养24 h后,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,确定无毒性姜黄素浓度。通过MTT法、流式细胞术分别检测添加姜黄素前后,UVA、UVB照射引起的HaCaT细胞损伤情况及胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平变化。结果姜黄素浓度在5μmol/L以下时,正常细胞的增殖和凋亡不受影响。添加姜黄素前,UVA照射引起细胞增殖抑制、凋亡增加(P0.05),ROS增高67.9%;UVB照射引起细胞增殖抑制、凋亡增加(P0.05),ROS增高67.2%。添加姜黄素后,UVA、UVB组细胞损伤均减轻(P0.05),ROS水平升幅均下降,呈浓度依赖型。结论对于不同波长的紫外线诱导损伤的HaCaT细胞,姜黄素均可降低急性光损伤引起ROS水平升幅,具有抗氧化保护作用,其保护强度无差异,并且呈浓度依耐性。     

Gene expression profiles of TNF-alpha, TACE, furin, IL-1beta and matrilysin in UVA- and UVB-irradiated HaCat cells

BACKGROUND/PURPOSE: It is known that solar ultraviolet (UV) irradiation exerts multiple effects on mammalian skin tissues, one of which is the induction of local and systemic immunosuppression as well as inflammation. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and other cytokines are suggested to play a role in these responses. Quantitative real-time polymerase chain reaction (TaqMan RTPCR) was used to elucidate the effect of UVA and UVB irradiation on the expression of genes coding for TNF-alpha, IL-1beta, IL-10, FasL, matrilysin, TACE and furin in HaCaT cells over a 48 h period (IL-1beta, interleukin-1beta; FasL, Fas ligand). METHODS: Cultured HaCaT cells were either sham irradiated (control) or exposed to UVA (2000 and 8000 J/m2) or UVB (200 and 2000 J/m2) radiation. RNA was extracted from cells at 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48 h post-irradiation and reverse transcribed to generate cDNA for subsequent real-time PCR amplification. RESULTS: Significant increases in the mRNA levels for all genes tested were detected in both UVA- and UVB-irradiated HaCaT cells compared with control (sham-irradiated) cells. TNF-alpha mRNA levels were immediately up-regulated (0 h) after irradiation, with maximal induction at 8 h post 2000 J/m2 UVA and 200 J/m2 UVB irradiation, at 4 h post 8000 J UVA irradiation and at 48 h post 2000 J/m2 UVB irradiation. No correlation was observed between TNF-alpha, TACE and furin mRNA induction in the different irradiated cohorts. CONCLUSION: Results suggest that time-distinct gene induction of TNF-alpha, furin, IL-1beta and matrilysin may be involved in UV-induced cellular responses, but not for TACE. In general, mRNA induction was dose dependent at some time points post-irradiation, but not throughout the whole time course tested. Our results show that quantitative real-time PCR is a useful tool in the analysis of quantitative changes of mRNA levels in cultured HaCaT cells after UV exposure.