侵染半夏的黄瓜花叶病毒RNA3全序列分析及侵染性克隆构建

对从我国甘肃省天南星科植物半夏上获得的黄瓜花叶病毒分离物（CMV-PGs）的RNA3进行全长克隆和序列分析及侵染性克隆构建．结果表明：CMV—PGsRNA3序列全长2179nt,与CMV—Fny株系RNA3的同源性为83．1％．选取已报道CMV株系的38个RNA3全长序列,根据CP核苷酸序列进行同源性比较,系统进化树分析表明：CMV-PGs属于亚组ⅠB,但是相对独立．进一步构建CMV—PGsRNA3的侵染性克隆,通过体外转录获得具有侵染活性的RNA转录本,将CMV—PGsRNA3的侵染性转录本与CMV—FnyRNA1和RNA2的侵染性转录本混合接种烟草,成功获得假重组体F1F2P3．     

黄瓜花叶病毒小青菜分离物RNA3全长序列分析

对侵染十字花科小青菜的黄瓜花叶病毒YN分离物（CMV-YN）RNA3进行全长克隆和序列分析．CMV-YNRNA3全长2220nt,分别编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP．序列同源性比较结果如下;CMV-YNRNA3核苷酸及其编码蛋白的氨基酸序列与亚组IA株系CMV-Fny、亚组IB株系CMV-Nt9、亚组Ⅱ株系CMV-Q的同源性,RNA3序列分别为92．7％、96．7％、74．2％,3a蛋白氨基酸序列分别为96．4％、98．6％、83．2％,CP氨基酸序列分别为97．7％、98．2％、83．1％．该结果表明CMV-YN与亚组IB株系CMV-Nt9的同源关系更密切．对CP核苷酸序列的系统进化树分析表明：CMV-YN归属于亚组IB,本研究为首次报道侵染我国十字花科植物的CMV基因组序列．     

黑线仓鼠4.5S RNA cDNA的克隆及序列分析

4.5S RNA是一种特异存在于啮齿类细胞中丰富的核小RNA分子（small nuclear RNA,snRNA）.研究以黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）为材料,从新鲜肝脏中提取总RNA,以此反转录4.5S RNA cDNA序列,并克隆测序,所得核苷酸序列为88 bp(Genbank登录号:HM1...     

新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。     

六安地区高粱花叶病毒P3基因的克隆和序列测定

从六安产甘蔗病叶中提取总RNA,逆转录获得甘蔗花叶病毒(Sorghun mosaic virus,SrMV)基因组cDNA。设计P3基因特异引物,通过PCR扩增P3基因,并将P3基因cDNA克隆、测序。     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

苜蓿花叶病毒RNA2 3‘端cDNA转基因烟草植株的抗病性分析

将人工合成的与苜蓿花叶病毒（ALMV）RNA2互补的寡核苷酸进行放射性同位素（γ-p^32ATP）标记，制备成探针。用ALMV攻毒转基因烟草和未转基因烟草，提取总RNA，用上述探针分析植珠体内病毒增殖情况，做抗病性分析。实验表明：转基因植珠（李颖同学做的转基因植株）有较强的抗病性，而未转基因的对照株却无抗病性。     

鲫血清转铁蛋白cDNA克隆及其序列分析

从GenBank数据库查询发表的鱼类转铁蛋白cDNA或基因序列，根据铁离子结合转运功能位点，设计并合成了两对引物P1、P4以及P2、P3，克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA中的核心片段，长度为866bp。再根据克隆出的核心片段分别设计上游及下游两对引物P5、P6以及P7、P8，随后用RACE方法分别克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA的5’端(787bp)和3’端(1081bp)以及全长cDNA，最后用计算机程序排列出鲫血清转铁蛋白全长cDNA，长度为2444bp。比较了12种鱼类血清转铁蛋白cDNA序列的同源性。     

黄瓜花叶病毒新疆株的桃蚜传播特性

研究了桃蚜传播黄瓜花叶病毒新疆株(CMV-XJ)的规律,结果表明：无毒蚜虫能够获毒的最短取食时间为30 s,获毒率随取食时间的延长而提高,取食时间为70 s以上时,获毒率达100%;带毒蚜虫传毒的最短取食时间为0.25 h,当取食时间超过最短传毒时间时,传毒率随取食时间的增加而升高,取食时间达2 h以上时,传毒率达100%;带毒蚜虫能够传毒的最少头数为1头,传毒率随单株植物带毒蚜虫数目的增加而升高,单株虫量达15头以上时,传毒率达100%.说明桃蚜可以高效率地传播黄瓜花叶病毒新疆株.     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

对硝基酚磷酸酶pNPPase的基因克隆和序列分析

对硝基酚磷酸酶（p-nitrophenylphosphatase pNPPase)是一种对硝基酚磷酸盐（p-intophenylphosphate)为底物的酶，被广泛地应用于核酸标记，通过菌落原位显色法成功地从脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)中克隆到了编码耐热pNPPase的基因，序列分析表明它是一个编码255个氨基酸的酶。     

罗汉果花叶病病原病毒鉴定

从典型病株上分离到1种大小为12nm*(600-800)nm的线状病毒,该病毒可通过汁液摩擦和棉蚜（Aphis gossypii)传播,人工接种可侵染罗汉果（Siraitia grosvenorii),西葫芦（Cucurbita pepo),南瓜（C.Moschata),黄瓜（Cucumis sativus),西瓜（Cirullus vulgaris),毛节瓜（Citrullus vulgaria)和瓠瓜（Lagenaria siceraria)等葫科植物引起花叶症状,侵染苋色藜（Chenopodium amaranticolor)引起局部褪绿斑点,接种番木瓜（Carica Papaya),普通烟草（Nicotiana tabacum),心叶烟（N,glutimosa),曼陀罗（Datura stramonium),洋酸浆（Physalis floridana),番杏（Tetragonia tetragonioides),豇豆（Vigna sinensis),未见有任何症状：病毒的致死温度为55度－60度,稀释终点为10^-3,10^-4,存在17度－25度下放置10d还有侵染活力;ELISA测定结果表明该病毒与西瓜花叶病毒－2（WMV－2）有密切的血清学关系,上述结果表明,引起广西罗汉果花叶病的病原病毒是WMV－2的一个株系,本研究还表明,罗汉果花叶病毒与番木瓜环斑病毒（PRSV）,马铃薯Y病毒＊PVY）,烟草蚀纹病毒（TEV）,大豆花叶病毒（SMV）及莴苣花叶病毒（LMV）均有较密切的血清学关系。     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

香蕉花叶病病原病毒及其卫星RNA的研究

进一步证明,我国华南地区香蕉叶病的病原病毒种类主要是由黄瓜花叶病毒引,在广西部分地区发现有烟草叶病毒的新株系感染香蕉。分离得到ＣＭＶ的卫星ＲＮＡ。     

侵染新疆辣椒CMV的外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现黄化的辣椒病株上获得分离物XJ-P,用1对CMV基因引物进行RT-PCR,扩增得到了774bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物克隆到pMD18-T载体中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制性内切酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR产物大小相同的774bp的插入片段。cDNA全序列分析表明,所扩增出的774bpCMV基因,含1个657bp开放阅读框架（ORF）,编码218个氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的CMVCP基因。所测得的XJ-P分离物其CP基因与CMV亚组Ⅰ、亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源性分别为90.84%-94.22%和74.37%-76.52%,氨基酸同源性分别为94.04%-98.17%和80.37%-82.19%,因此将该分离物鉴定为黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ。