弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫Ｐ３０蛋白,采用定向克隆的方法,自行设计引物通过ＰＣＲ扩增得到Ｐ３０基因片段,用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切后,连接到同样酸切的原核表达载体（ｐＢＶ２２０和ｐＭＡＬＰ２）上,转化大肠杆菌ＤＨ５α,分别得到含重组闰ｐＢＶ２２０－Ｐ３０和ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０的工程菌,扩菌提取质粒经过酶切分析和ＰＣＲ扩增鉴定后,证实Ｐ３０基因的两个原核表达载体构建成功,为其在原核系统中的表达作     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大肠杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并以SDS－PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 1、在我们比较的783个碱基中,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同;2、得到－分子量为54kDa的融合蛋白,占大肠杆菌总蛋白的38％。结论 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。     

引形虫P30抗原基因的体外扩增,克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养在初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3．1-P30-ROP2真核表达重组质粒，为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段，重组人puC18克隆载体，然后将pUC18-P30-ROP2中的P30-ROP2外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组中扩增m特异的P30、ROP2片段，克隆成功pUC18-P30-ROP2重组质粒；经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-ROP2重组表达质粒。结论 成功构建了弓形虫puC18P30-ROP2重组克隆质粒，亚克隆成功pcDNA3．1-P30-ROP2直核表达重组质粒，为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

弓形虫主要表面抗原P30基因的原核融合表达及鉴定

目的在已建 P30克隆载体的基础上,进一步构建表达质粒,诱导以融合蛋白形式表达的能被免疫血清识别的 P30蛋白,并探索最佳表达条件。方法双酶切 P30克隆载体和空白表达质粒 PGEX-4T-1,连接后转化入 DH5α进行 PCR 筛选,酶切鉴定和测序验证。重新将重组质粒转化入表达宿主菌 BL21进行诱导。对比不同诱导时间的菌体蛋白 PAGE 图谱,并进行 Western blot鉴定。改变诱导物浓度和培养温度,优化出最佳表达条件。结果构建成功序列和读框正确的重组质粒并表达出特异性 P30抗原,该抗原能被抗弓形虫蛋白血清识别。表达产量在 IPTG 为0.1mM时较高,而培养温度影响不大。结论表达出的具有免疫原性的重组蛋白,经纯化和切割后,可为研究 P30在虫体入侵,诱发机体免疫反应中的作用及疫苗和诊断试剂的开发提供充足的条件。     

含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。     

弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆

扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因,构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术,自行设计一对寡核苷酸引物（P1,P2）,从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨共青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因,构建重组质粒PcDNA3—P30,酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30,为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫主要表面抗原基因编码序列的扩增、克隆及原核融合表达

目的扩增弓形虫主要表面抗原（P30）基因编码序列并进行重组表达方法设计合成引物,从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因编码序列,克隆入载体pGEM-T和PGEX-4T-1,经PCR和酶切筛选,测序验证后,进行诱导表达和Westemblot鉴定结果从弓形虫基因组DNA中扩增出P30基因编码序列,并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P30结论P30克隆载体和GST融合表达载体的构建和P30的成功表达,为进一步从基因水平和蛋白水平研究P30及进行诊断试剂和疫苗研究创造了条件。     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的克隆与测定

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

弓形虫主要表面抗原基因( P30)大肠杆菌中以融合蛋白形式的初步表达(英文)

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（ Ｐ３０）的基因序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出 Ｐ３０ 基因,将 Ｐ３０ 基因克隆入表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｅ Ｘ１ 中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌 Ｊ Ｍ １０９（ Ｄ Ｅ３ ）,宿主菌经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达后,产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示, Ｐ３０ 基因以融合蛋白的形式表达,表达产物具有特异的免疫反应性。