慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞与K562细胞共培养对伊马替尼耐药的影响

背景：伊马替尼耐药是慢性髓细胞白血病治疗的一个主要问题,研究证实白血病细胞可通过与骨髓基质细胞黏附而获得耐药表型,但对于黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言,骨髓基质细胞在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。 目的：体外模拟慢性髓细胞白血病患者骨髓微环境,探讨其对伊马替尼敏感性的影响及可能机制。 方法：分离、培养确诊但未经治疗的慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞,与白血病细胞株K562细胞共培养构建慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型。MTT法检测0.2-3.2 μmol/L伊马替尼作用  48 h对K562细胞的增殖抑制率;将K562细胞暴露于0.5 μmol/L伊马替尼72 h,流式细胞术检测K562细胞凋亡率及CXCR4表达。将0.5 μmol/L伊马替尼作用4 h并以Calcein-AM荧光标记的K562细胞接种于基质细胞层培养24 h,去除悬浮细胞,收集黏附的K452细胞通过检测荧光强度计算细胞黏附率。 结果与结论：慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞与K562细胞共培养减弱了0.2-3.2 μmol/L伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用;0.5 μmol/L伊马替尼处理72 h,共培养组K562细胞凋亡率显著低于悬浮组(P=0.020)。悬浮组和共培养组伊马替尼作用后K562细胞CXCR4表达阳性率均显著高于作用前(P=0.001)。0.5 μmol/L伊马替尼作用4 h使K562细胞与骨髓基质细胞的黏附率由(32.18±6.17)%提升至(68.97±11.08)%,差异有显著性意义(P=0.022)。结果表明慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞与K562细胞共培养,能介导对伊马替尼耐药,可能与共培养及伊马替尼诱导K562细胞CXCR4的表达有关,但更多的机制还需深入研究。     

MSCs分泌的肝细胞生长因子对人髓系白血病细胞系K562及其耐药株K562/G01增殖及药物敏感性的影响

目的研究骨髓造血微环境中间充质干细胞(MSCs)分泌的肝细胞生长因子(HGF)对人白血病细胞K562及其耐药珠K562/G01细胞增殖及药物敏感性的影响。方法采用细胞贴壁法获取MSCs,选用人慢性髓系白血病急性红白血病变细胞系K562及其耐药系K562/G01。K562、K562/G01细胞分别与白血病患儿MSCs黏附共培养,实验组为加HGF抗体组,对照组加入等量培养液,通过显微镜观察白血病细胞在MSCs层上的黏附情况并计算黏附率,MTT法检测白血病细胞增殖情况,流式细胞仪测定白血病细胞周期。在共培养各组中加入伊马替尼孵育48 h后,流式细胞仪检测白血病细胞凋亡率。结果实验组中MSCs对K562和K562/G01细胞的黏附率分别为32. 4%±3. 2%和38. 1%±4. 8%,均分别低于对照组的51. 6%±3. 6%和62. 2%±4. 9%(P0. 05)。实验组中K652和K562/G01细胞的A值分别为(0. 310 2±0. 039 0)和(0. 324 6±0. 035 8),均分别低于对照组的(0. 521 6±0. 046 7)和(0. 590 8±0. 003 4)(P0. 05)。实验组中K652及K562/G01细胞处于G0/G1期的细胞比例均高于对照组,而处于S期的细胞比例低于对照组(P0. 05)。加入伊马替尼孵育48 h后白血病细胞凋亡情况:实验组中存活细胞比例低于对照组中存活细胞比例(P0. 05)。结论 HGF可通过影响细胞黏附及细胞周期促进K562及K562/G01细胞存活与增殖,并降低伊马替尼对白血病细胞的杀伤作用。     

丙戊酸协同伊马替尼诱导K562细胞凋亡并下调Bcr/Abl mRNA和磷酸化蛋白激酶B的表达

 目的：探讨丙戊酸联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562凋亡的影响,同时探索其可能的作用机制。方法：K562细胞分别用丙戊酸、伊马替尼以及两药联合处理。检测各组细胞在药物处理后的细胞周期、细胞凋亡、Bcr/Abl mRNA 水平、总蛋白激酶B（PKB）以及磷酸化PKB （p-PKB）水平。结果：丙戊酸组、伊马替尼组和两药联用组K562细胞凋亡率分别为(11.47±0.25)％、(28.43±1.70)％和(57.73±4.38)% (P<0.05),对于细胞周期各指标,两药联用组与单药组无明显差异。Bcr/Abl mRNA以及p-PKB在丙戊酸组、伊马替尼组和两药联用组的水平分别为(0.00±0.00)、(64.17±12.27)和(0.00±0.00)×10 9 copies/(g total mRNA)以及0.25±002、0.17±0.01和0.08±0.01(均P<0.05),总PKB 3组细胞间无明显差异。结论：丙戊酸能协同伊马替尼促进K562细胞凋亡,其作用机制可能与降低Bcr/Abl mRNA和p-PKB水平有关。     

白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性

背景:骨髓微环境是白血病的发病根源,微环境的改变对白血病细胞的生物学行为和性能有一定的影响。目的:探讨白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞生长增殖及凋亡的影响。方法:体外环境下进行K562/AO2细胞单独悬浮培养,K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养。锥虫蓝染色计数活细胞数,描绘两组细胞生长曲线,PI单染法检测细胞周期,Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况。结果与结论:(1)单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变,第4天开始细胞增殖速度明显加快,并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓,无明显的增殖高峰;(2)单独培养组的G0-G1期细胞比例显著低于共培养组,S期细胞比例显著高于共培养组(P<0.05)。两组G2-M期细胞比例差异无显著性意义;(3)单独培养组的细胞凋亡数显著高于共培养组(P<0.05);(4)结果表明,与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后K562/AO2细胞生长受到抑制,细胞周期阻滞在G0-G1期,且会对K562/AO2细胞凋亡产生抵抗作用。     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

地西他滨对K562/A02细胞阿霉素耐药性的影响

 目的: 观察地西他滨(DAC)对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02阿霉素(ADR)耐药性的影响,探讨其作用的可能机制。方法: 分别或联合应用不同浓度ADR和DAC作用于K562/A02细胞和其亲本细胞株K562,采用CCK-8法检测药物细胞毒性,Sequenom MassARRAY系统结合比色法评价DNA甲基化程度,流式细胞术检测K562/A02细胞细胞周期分布和细胞凋亡率。结果: K562/A02细胞较K562细胞具有显著ADR耐药性,前者ADR作用24 h的IC₅₀约为后者的50倍。而对DAC,在0.5~8 μmol/L作用浓度范围内,K562/A02细胞则较K562细胞更敏感。在相同ADR作用浓度(4.31和17.24 μmol/L)下,联合1 μmol/L DAC处理24 h能显著提高K562/A02细胞对ADR的敏感性,细胞存活率下降(P<0.05)。DAC和ADR均能影响K562/A02细胞的细胞周期进程和细胞凋亡率。1 μmol/L DAC的影响与作用时间相关,在作用24 h时以S期阻滞与细胞早期凋亡率升高为主,48 h时以G₂/M期阻滞与细胞晚期凋亡和坏死率升高为主。ADR则主要表现为浓度依赖性G₂/M期阻滞并诱导细胞晚期凋亡和坏死。两者联用使ADR对细胞周期分布的作用进一步加强,即表现为G₂/M期阻滞更加明显,但对细胞凋亡率的影响并无显著差异。而在基因组甲基化程度上,2种细胞没有显著差异,DAC作用前后也没有显著改变。结论: DAC能增强K562/A02细胞对ADR的敏感性,具有逆转耐药作用,其机制可能与调节K562/A02细胞细胞周期进程、促进细胞凋亡和坏死有关。     

c-Myc抑制剂10058-F4对伊马替尼耐药细胞的增殖抑制作用

 目的：探讨c-Myc小分子抑制剂10058-F4对慢性粒细胞白血病细胞K562及伊马替尼耐药的K562/G细胞的影响,为克服耐药提供新的治疗策略。方法：Western blotting测定细胞中c-Myc蛋白表达水平,PI染色检测细胞周期。MTT法及克隆形成实验测定K562及K562/G细胞的增殖情况,Annexin V-PI染色检测细胞凋亡。结果：MTT结果显示,耐药细胞K562/G与K562细胞相比,对伊马替尼的敏感性明显降低;Western blotting检测结果表明耐药细胞具有c-Myc蛋白高表达的特点。进一步MTT结果显示,与对照组相比,c-Myc小分子抑制剂10058-F4可抑制K562及K562/G细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性。重要的是,K562/G细胞比K562细胞对10058-F4敏感性更高。细胞周期检测显示,10058-F4可使K562及K562/G细胞周期阻滞于G0/G1期,表明抑制c-Myc导致的增殖抑制与细胞周期阻滞相关。Annexin V-PI染色结果显示10058-F4可促进K562及K562/G细胞发生凋亡。克隆形成实验表明K562/G耐药细胞的克隆形成数目明显高于K562细胞。同时,与对照组相比,10058-F4可抑制细胞的克隆形成能力,并增强伊马替尼的毒性作用。结论：耐药细胞K562/G具有c-Myc高表达的细胞遗传学特点;10058-F4可抑制K562及K562/G细胞增殖,促进凋亡,并抑制细胞的克隆形成能力;c-Myc抑制剂10058-F4可逆转c-Myc高表达引起的耐药。     

K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原的表达

背景：白血病侧群细胞表型的研究对于理解肿瘤细胞的异质性和起源、分子标记和靶向治疗等都有积极意义。 目的：鉴定人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在侧群细胞,并观察侧群细胞亚群与非侧群细胞亚群中部分白细胞分化抗原的表达差异。 方法：采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在侧群细胞;并进一步分析K562侧群细胞和非侧群细胞两亚群间CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38+、HLA-DR+细胞的表达情况。 结果与结论：经Hoechst33342染色,流式细胞仪分析结果显示在K562中存在侧群细胞,这部分细胞比例少,为(2.7±0.5)%;统计学分析侧群细胞和非侧群细胞亚群中CD34⁺、CD34⁺CD38^-细胞表达率差异有显著性意义,而CD34⁺CD38⁺细胞表达率和HLA-DR+细胞表达率差异均无显著性意义;侧群细胞和非侧群细胞相比在分化抗原表达上有异质性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Toll样受体1对间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用

背景：课题组前期研究表明间充质干细胞具有免疫调节Th17细胞的作用,但内在的调节机制尚待阐明,为此,针对Toll样受体1在其中的作用进行探讨,为今后潜在的细胞治疗策略提供可能的实验依据。目的：探讨Toll样受体1对间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用。方法：贴壁法分离人胚胎骨髓来源间充质干细胞,免疫磁珠法分离正常人CD4⁺ T细胞。CD4⁺ T细胞单独培养或与间充质干细胞共培养4 d。实时定量聚合酶链反应测定白细胞介素17、Toll样受体1相关基因的表达水平;流式细胞仪检测Th17细胞的数量。结果与结论：CD4⁺ T细胞及间充质干细胞均表达Toll样受体1。相对于CD4⁺单独培养组,间充质干细胞共培养组(间充质干细胞+CD4)白细胞介素17明显升高(3.59±0.11,1.14±0.08,P < 0.01);进一步发现Toll样受体1 mRNA表达水平亦相应升高(6.07±1.79,1.53±0.63,P < 0.01)。流式细胞仪检测发现,共培养组(间充质干细胞+CD4)Th17细胞数量明显高于CD4⁺ T细胞组[(4.53±1.27)%,(2.39±0.80)%,P < 0.01)。研究结果表明Toll样受体1可能参与间充质干细胞免疫调节人Th17细胞的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

基质细胞衍生因子1预处理抑制大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

背景：研究发现基质细胞衍生因子1除参与趋化干细胞定向迁移途径,还具有抗凋亡作用。 目的：观察基质细胞衍生因子1预处理后对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 方法：以不同浓度H₂O₂诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,取最适宜浓度100 μmol/L用于实验。不同质量浓度基质细胞衍生因子1干预100 μmol/L H₂O₂诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞,选择0.2 mg/L最佳保护质量浓度用于实验。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,随机分组：正常对照组不进行任何处理;损伤组在培养液中加入H₂O₂作用24 h;基质细胞衍生因子1预处理组于H₂O₂损伤细胞前6 h加入基质细胞衍生因子1;基质细胞衍生因子1+AMD3100(基质细胞衍生因子1受体CXCR4的阻断剂)组于H₂O₂细胞损伤前6 h加入基质细胞衍生因子1与AMD3100共孵。 结果与结论：H2O2能体外模拟缺血缺氧环境诱导骨髓间充质干细胞凋亡,且作用呈剂量依赖性。与损伤组比较,加入基质细胞衍生因子1预处理后细胞凋亡明显减轻(P < 0.01),细胞E2F6基因表达增强(P < 0.05),E2F1基因表达减少(P < 0.05),线粒体细胞色素C转位减少(P < 0.05),Caspase-3活性降低(P < 0.05),AMD3100可阻断基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的保护作用。提示基质细胞衍生因子1可能通过增强E2F6基因,负性调控E2F1基因抑制线粒体损伤导致的骨髓间充质干细胞凋亡。     

抑制白血病K562细胞FoxM1表达可增强细胞对高三尖杉酯碱的敏感性

目的:探讨抑制白血病K562细胞叉头框蛋白M1(Fox M1)是否增强细胞对高三尖杉酯碱(HHT)的敏感性。方法:HHT以不同浓度(0、0.015、0.030和0.045μmol/L)和最低起效浓度不同时间(0.015μmol/L,0、24、48和72 h)作用于K562细胞,real-time PCR和Western blot检测Fox M1 mRNA和蛋白表达;以0.015μmol/L HHT作用K562细胞后转染Fox M1 siRNA,观察沉默K562细胞Fox M1后细胞对HHT的敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及Fox M1相关靶分子c-Myc和Sp1表达状况。结果:随着HHT浓度增加和时间延长Fox M1表达逐渐降低,说明HHT抑制K562细胞Fox M1表达;HHT处理K562细胞后转染Fox M1 siRNA,细胞生长和克隆形成显著下降,细胞凋亡增加,因此抑制Fox M1可增加K562细胞对HHT的敏感性;Fox M1 siRNA组c-Myc和Sp1表达显著降低,表明Fox M1可正性调控c-Myc和Sp1表达。结论:HHT可以抑制白血病K562细胞Fox M1表达,干扰Fox M1可增强细胞对HHT的敏感性。     

辛伐他汀对高糖高脂诱导人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

背景：研究表明,他汀类药物能够促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附能力,抑制高糖高脂培养下骨髓间充质干细胞的凋亡。 目的：观察辛伐他汀对高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 方法：将0.001,0.01,0.1,1.0 μmol/L辛伐他汀分别与高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞培养48 h,以正常培养骨髓间充质干细胞及高糖高脂诱导条件下培养的骨髓间充质干细胞为对照。倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法比较不同浓度辛伐他汀对高糖高脂环境下骨髓间充质干细胞存活率的影响,应用流式细胞术检测细胞凋亡,加入PI3K/Akt信号转导通路抑制剂LY294002后辛伐他汀对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 结果与结论：与高糖高脂诱导组比较,辛伐他汀0.01,0.1,1.0 µmol/L组骨髓间充质干细胞存活率均升高(P < 0.01),其中辛伐他汀浓度在0.1 μmol/L时骨髓间充质干细胞存活率升高最显著(P < 0.01);同时流式细胞仪检测结果显示,辛伐他汀0.01,0.1,1.0 µmol/L组细胞凋亡率下降(P< 0.01),其中0.1 µmol/L组凋亡率下降最显著(P < 0.01)。0.1 µmol/L辛伐他汀对骨髓间充质干细胞的影响可被LY294002阻断。说明辛伐他汀能抑制高糖高脂诱导条件下骨髓间充质干细胞的凋亡,其机制可能与PI3K/Akt信号途径有关。     

透骨消痛颗粒水提与醇提物含药血清干预骨髓基质干细胞活性的实验研究

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径,在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势,可能为治疗骨性关节炎提供新思路。 目的：观察透骨消痛颗粒水提与醇提物含药血清对骨髓基质干细胞活性的影响。 方法：制备透骨消痛颗粒水、醇提物,108只SD大鼠随机摸球法均分为低、中、高剂量对照组、水、醇提物组,腹主动脉采血制备含药血清。取4周龄SD大鼠四肢骨髓基质干细胞,第3代同步化后用含药血清进行干预,MTT检测其活性,流式细胞仪检测其周期分布,Real time PCR检测Cyclin D1 mRNA表达,Western Blot检测Cyclin D1蛋白表达。 结果与结论：透骨消痛颗粒水、醇提物含药血清干预48 h后,软骨细胞的A值中高剂量组明显高于对照组(P < 0.01,P < 0.05);各组G₀/G₁期细胞,水、醇提物组明显低于对照组(P < 0.01),水提物组明显低于醇提物组(P < 0.05);各组增殖指数及Cyclin D1 mRNA及蛋白表达水、醇提物组明显高于对照组(P < 0.01),水提物组明显高于醇提物组(P < 0.05)。说明透骨消痛颗粒水醇提物含药血清通过上调Cyclin D1的表达,加速骨髓基质干细胞周期的进程,从而促进其增殖,且透骨消痛颗粒水提物的效果优于醇提物。     

乙烯雌酚可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化

背景：关于雌激素对骨髓基质干细胞作用的报道尚不多。 目的：观察乙烯雌酚对兔骨髓基质干细胞成骨分化的影响。 方法：体外培养骨髓基质干细胞,用0,10^-7,10^-6,10^-5 mol/L浓度乙烯雌酚干预,并设地塞米松10^-8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L为阳性对照。 结果与结论：乙烯雌酚干预培养24,48,72 h,10^-6 mol/L组显著促进了骨髓基质干细胞增殖(P < 0.01)。干预48 h 10^-5 mol/L组显著抑制细胞增殖,干预72 h 10^-7 mol/L组显著抑制细胞增殖(P < 0.01)。10^-7 mol/L组乙烯雌酚干预25 d后开始出现钙化结节;10^-7,10^-6 mol/L组干预14,21 d碱性磷酸酶活性显著增加。证实乙烯雌酚能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化。     

芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:探讨抗寄生虫药芬苯达唑对慢性髓系白血病细胞K562的作用及机制。方法:采用CCK-8法检测芬苯达唑对K562和正常人外周血单个核细胞(PBMC)生长的影响;台盼蓝拒染实验检测芬苯达唑对K562细胞活力的影响;瑞氏染色观察芬苯达唑对K562细胞形态的影响;流式细胞术检测芬苯达唑对K562细胞周期分布的影响;Western blot检测芬苯达唑对K562细胞周期相关蛋白表达的影响;免疫荧光观察芬苯达唑对K562细胞核的改变。结果:芬苯达唑能够显著抑制K562细胞的生长,而对PBMC生长无明显影响;进一步的研究发现,芬苯达唑显著抑制K562细胞增殖并诱导细胞发生G_2/M期阻滞;芬苯达唑处理K562细胞后,细胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)磷酸化、周期素依赖性激酶1(Cdk1)-Tyr15去磷酸化以及cyclin B1磷酸化增加;免疫荧光结果证实芬苯达唑诱导K562多核细胞增多(P0.01),发生有丝分裂灾难。结论:芬苯达唑通过调控周期相关蛋白诱导K562细胞发生G_2/M期阻滞。     

诱导剂共培养：谁更适宜骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化？

背景：目前骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法较多,采用不同诱导方法对骨髓充质干细胞分化成神经细胞的比例是不同的。 目的：比较化学诱导法和共培养法诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的差异。 方法：大鼠全骨髓血细胞分离纯化法培养骨髓间充质干细胞,分为化学诱导组和共培养组,分别采用加入化学诱导剂β-巯基乙醇和Transwell小室共培养方法诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。 结果与结论：诱导培养1周后从化学诱导和共培养组的骨髓间充质干细胞出现突起,且呈辐射生长,2周后均可见神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。共培养组中第四五天可见星级神经细胞状结构,并形成更多的突起,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为(70.82±2.46)%。而在第六七天化学诱导组中神经细胞形态样细胞形成,并有连接,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为(52.37±1.83)%。提示细胞微环境在骨髓间充质干细胞分化成神经细胞发挥主导作用,且化学诱导法诱导效率低于共培养法。