鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低分子量尿激酶融合蛋白在？…

目的;构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合蛋白,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质中粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株中,转染细胞经选择培养基筛选。     

水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列，通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因，结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。     

外源基因在大肠杆菌中的表达

随着生物技术的迅猛发展,采用基因工程方法大量制备一些有用蛋白质,特别是医用蛋白质药物已成为可能.目前,表达系统可分为原核表达系统和真核表达系统.原核表达系统主要是指大肠杆菌表达体系,其它尚有枯草杆菌体系等;真核表达系统包括酵母细胞表达体系、杆状病毒-昆虫细胞表达体系和哺乳动物细胞表达体系.各种表达体系都     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体在大肠杆菌中的表达

 目的 制备可溶性抗甲状腺刺激性免疫球蛋白(TSI)单链抗体。方法 构建的抗TSI单链抗体可溶性表达载体,转化E.coli XL 1-blue进行表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和ELISA检测,同时对表达条件作了初步探索。结果 抗TSI单链抗体可溶性表达于细菌培养上清和周质间隙,大小约30 KDa,具有抗TSI活性。温度、诱导物浓度及蔗糖对抗TSI单链抗体的表达产量有一定影响。结论 抗TSI单链抗体可溶性表达成功,为制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达

在本室构建的抗乙肝病毒表面抗原单链抗体表达载体pHBSCS的基础上,通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中,构建了单链抗体高效表达载体pT7SC.将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得ScFv的高效表达,经SDS-PAGE检测,表达产物占菌体总蛋白的28%以上.对IPTG诱导后的细菌培养上清进行竞争抑制性ELISA检测,证明所表达的ScFv具有抗体活性.     

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的原核表达载体,并在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达可溶性的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ。以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经ＮｃｏⅠ／Ｎｏｔ Ⅰ酶切鉴定,该ＳｃＦｖ基因由７５０ｂｐ组成。将其亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ表达载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取质粒进行ＤＮＡ序列测定,符合ＳｃＦｖ的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。ＩＰＴＧ诱导转化的大肠杆菌ＪＭ１０９,在其培养上清中获得了可溶性ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ的表达。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证实表达的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡ     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术,将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒,经SfiI／Not I酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀,并进行SDS-PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗-Id scFv片段基因由774bp组成。SDS-PAGE电泳表明,大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD。结论 HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功,为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒，并在大肠杆菌DH5d中高效表达。方法：利用基因工程的方法，将含有cS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切，得到长约3．1kb的CS6片段(含有cS6结构基因及调控基因的DNA片段)；并与用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切的表达载体质粒pBV321连接．得到含有CS6片段的重组质粒pMG235，转化至大肠杆菌DH5a。结果：SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明，重组菌DH5a／pMG235可高效表达相对分子质量为14600的CS6抗原蛋白，并在重组菌表面表达，表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别。结论：重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

单链抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖＳｃＦｖ）是由抗体重链要变区ＶＨ和轻链可变区ＶＬ通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，由于其分子量小穿透力强，免疫原性代，利于基因工程操作等特点，而具有良好的应用前景，近年来国内外学者对单链抗体进行了大量研究，本室构建了抗乙肝病毒表面抗原ＨＢｓＡｇ的单链抗体ＳｃＦｖ，并在大肠杆菌表达体系中以包含体工形式获得高效表达，由于包含体为没有活性的变性蛋白，其纯化和复性是大量     

TRAP蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒素的调控机制，构建pET—trap表达载体，在大肠杆菌中表达金葡菌毒素调控的重要分子TRAP蛋白。方法：从金葡菌中提取基因组DNA，用特异引物钓取trap基因。通过亚克隆的方法构建了pET—trap表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经亲和柱层析分离纯化。制备纯化蛋白的多抗血清，利用Western印迹检测多抗与天然蛋白的反应。结果：目的基因在大肠杆菌中获得高表达，超声破碎后，表达产物主要存在于上清中，制备的多抗血清可以与天然蛋白发生特异性反应。结论：通过原核表达获得了天然的TRAP蛋白，为研究金葡菌毒素调控机制及防治金葡菌感染奠定了基础。     

葡激酶基因的分离及其在大肠杆菌中的高效表达

分离葡激酶基因并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。方法：利用ＰＣＲ技术自溶源性金黄色葡萄球菌ＦＲ６１０株的染色体ＤＮＡ中分离葡激酶编码序，ＤＮＡ序列分析后，组入高效表害载体ｐＢＶ２２０中，转化至大肠杆菌。     

人白介素17基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从活化的人外周淋巴细胞中分离了人白１７基因，序列分析结果表明与文献报道的完全相符，以质粒ｐＢＶ２２０为表达载体，在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ－１７基因，重组蛋白以包涵体的形式存在，约占菌体总蛋白的量４０％。     

烷烃羟化酶基因alkB表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的 构建烷烃羟化酶基因alkB表达载体并检测其在大肠杆菌的表达.方法 体外合成alkB基因,选择烷烃表达载体pCom8,构建含alkB基因的重组质粒pCom8-alkB,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌DH5α中,通过十二烷基碘酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同诱导条件下的alkB基因表达的变化.结果 构建的含alkB基因的重组质粒在DH5α中得到有效表达,且随诱导时间的延长而增加,在柴油诱导浓度为2％～3％(V/V)时,目的蛋白表达量相对较大.结论 成功构建了含alkB基因的表达载体,阐明了不同诱导条件对目的蛋白表达的影响规律.     

PL启动子控制的乙型肝炎核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

应用乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对其相应的抗体(抗HBc)及抗HBcIgM的检测,对乙型肝炎的临床诊断、分型、流行病学调查以及对乙肝疫苗安全性鉴定等都具有重要意义。但因HBcAg来自乙肝病人的尸肝或富含Dane颗粒的病人血清中,因此来源困难,不能大量生产。1981年以来,国外报导了应用基因工程技术在大肠杆菌中合成HBcAg来检测抗HBc,取得较好结果。我们实验室于1982年构建了adw亚型HBV无性繁殖系。随后采用bla启动子使HBcAg在大肠杆菌中获得表达,并以这种抗原用ELISA方法检测乙肝病人血清中抗-HBc和抗HBcIgM,获得比较满意的效果。在此基础上,应用基因工程技术构建更高表达HBcAg的工程菌株,本文报告采用γ噬菌体PL启动子,使HBc基因在大肠杆菌中表达。     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

血管生成素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

目的：利用原核表达系统获得重组血管生成素(Ang)并研究其生物学活性。方法：构建高效融合表达载体pGEx4T—Ang，诱导表达后利用亲和层析的方法纯化目的蛋白，经切割后获得非融合的重组人Ang，利用Westem印迹检测表达产物的特异性，通过鸡胚尿囊膜血管增生实验检测重组蛋白的生物学功能。结果：表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，亲和层析纯化蛋白的纯度在90％，能够与Ang抗体产生特异性反应，并具有明显的促进血管新生的活性。结论：原核表达的重组Ang具有良好的生物学活性。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽（12肽）融合表达及特性…

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶性活性，同时人血纤蛋白附肽（１２肽），的抗血纤收白单体聚合的活性。