真菌EST-Ⅰ及EST-Ⅱ对人参皂苷Rg_1定向转化为人参皂苷F_1的研究

目的筛选能将人参皂苷Rg1定向转化为稀有人参皂苷F1的真菌。方法通过硅胶柱色谱从三七总皂苷中分离纯化出人参单体皂苷Rg1;采用固体与液体发酵培养法,从325株真菌中筛选到能对单体人参皂苷Rg1进行生物转化的菌株。采用1H-NMR1、3C-NMR波谱手段及理化性质鉴定人参皂苷Rg1及其转化产物。结果发现真菌菌株EST-Ⅰ与EST-Ⅱ将人参皂苷Rg1定向转化为人参皂苷F1,说明两种菌株能产生特异性水解C-6位葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。结论该方法是一种制备稀有人参皂苷F1的新方法。     

人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物的制备和表征

目的考察人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺及其表征。方法比较研磨法和水溶液搅拌法制备人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物,以包合率为指标,采用L9(34)正交试验设计优化包合工艺条件,采用薄层色谱法、DSC差热分析、红外光谱法、X-射线衍射法等分析手段对包合物进行表征,测定包合物的体外溶出度。结果选择水溶液搅拌法制备包合物,最佳包合工艺为人参皂苷Rg3与羟丙基-β-环糊精的质量比1∶100,搅拌时间2 h,温度25℃,其包合率为86.11%,通过表征说明包合物已经形成,包合物的溶出速率明显提高。结论人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺稳定可行,溶解性显著提高。     

里氏木霉β-葡萄糖苷酶的研究进展

本文系统介绍里氏木霉β-葡萄糖苷酶的概况、酶学特性、结构、催化机理,以及近年国内外的应用现状和研究前景。     

β-葡萄苷酶转化松脂醇二葡萄糖苷元的制备工艺

目的:利用β-葡萄糖苷酶催化水解杜仲主要降压活性成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG),制备其苷元(PDG-A).方法:对水解反应时间、pH及温度等条件进行优化,并采用液相质谱联用和核磁共振波谱等手段对产物进行结构解析.结果:β-葡萄糖苷酶水解PDG的最佳条件为:水解时间6h,水解pH5,水解温度50℃,三次实验的PDG-A收...     

α-葡萄糖苷酶抑制剂固定化酶模型的建立及其对孔雀草不同组分的筛选

目的建立筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型,进行孔雀草中活性组分的筛选研究。方法采用共价交联法固定α-葡萄糖苷酶,模拟其在体内小肠壁上的情况,建立固定化酶筛选模型。使用α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖对该模型进行验证。然后用该筛选模型对孔雀草4种提取组分进行筛选。结果固定化酶的筛选模型更稳定,且可重复利用。孔雀草水煎液和上清液组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率最强,醇沉组分次之,挥发油组分几乎无抑制作用。结论该筛选模型能很好地进行中药体外α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的构建糖类标记载体筛选克隆。方法以pPIC9K-βGl2为模板,通过PCR扩增得到全长的Bgl2基因片段,克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21(DE3),Cel-M9培养基筛选阳性克隆,经DNA测序分析,成功构建pET28a-Bgl2表达载体。SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。结果 PCR扩增得到Bgl2基因片段,SDS-PAGE显示蛋白以包涵体形式表达,克隆可用Cel-M9培养基筛选。结论用Cel-M9培养基筛选出阳性克隆为构建食品级载体奠定基础。     

用固定化酶筛选模型从天然产物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂

目的:用固定化酶筛选模型从天然产物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂.方法:把α-葡萄糖苷酶固定化,模拟其在体内小肠壁上的情况,建立固定化酶筛选模型,先用α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖对该模型进行验证,然后用该筛选模型对2种天然产物-虎杖水溶性部位和广西血竭甲醇溶液进行筛选.结果:阿卡波糖对固定化α-葡萄糖苷酶和游离α-葡萄糖苷酶的IC50分别为0.413 mg·mL-1和0.126 mg·mL,虽然固定化酶被阿卡波糖抑制的IC50值是游离酶的3.3倍,但固定化酶筛选模型更准确地反映阿卡波糖的体内作用.虎杖水溶性部位和广西血竭的甲醇溶液对固定化α-葡萄糖苷酶的IC50分别为0.224 mg·mL-1和5.5 μg·mL-1.结论:该筛选模型能很好的进行体外α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选,其筛选结果和文献报道相符.     

染料木素与β-葡萄糖苷酶相互作用的研究

本文研究了染料木素与β-葡萄糖苷酶的相互作用。采用荧光光谱法研究了染料木素与β-葡萄糖苷酶的结合反应,二者的相互作用使β-葡萄糖苷酶发生内源荧光猝灭,属于静态猝灭机制。通过计算得到染料木素与β-葡萄糖苷酶在17、27和37℃下的结合常数分别为3.69×104、3.06×104和2.36×104 L·mol-1。同步荧光研究了染料木素对β-葡萄糖苷酶结构的影响,染料木素可使β-葡萄糖苷酶的构象发生变化、色氨酸残基所处微环境的疏水性降低。染料木素对酶活性的抑制试验结果表明其对酶的活性具有明显的抑制作用,双分子结合速率常数为1.2×103(mol·L-1)-1.min-1。结合AutoDock 4.2分子对接软件模拟研究了二者的键合模式和键合机制,表明氢键和疏水作用对染料木素与β-葡萄糖苷酶的结合起重要作用,同时还存在静电作用。     

β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺研究

目的:研究用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺。方法:采用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,以转化率为指标,通过单因素试验考察温度、pH值、酶与底物质量比、底物浓度和反应时间对转化率的影响。结果:酶解反应的优化条件为温度50℃、pH=5.0的枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液、酶与底物质量比1:2、底物浓度1mg·mL-1、反应时间90min。结论:β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,转化率高,工艺简单、可靠,反应条件温和。     

苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究

目的建立苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的最优条件,为进一步阐明苦杏仁炮制原理及储藏养护条件研究提供依据。方法采用比色法,以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷为底物,考察苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件。结果苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件为p H=5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,反应温度50℃,底物浓度50 mmol·L~(-1),反应时间30 min,于400 nm波长条件下检测β-葡萄糖苷酶活性。结论确定了测定苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性的最佳条件,为进一步研究苦杏仁"杀酶保苷"炮制原理、储藏养护条件及储藏期奠定基础。     

RRLC法分离分析人参中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1

目的：用快速分离液相色谱法分离测定人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，的含量。方法：采用ZOBAX SB—C18柱（1．8μm，3．0mm×50mm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～14min，19％A；14～24min，19％A→36％A；24～26min，36％A）；流速：1．0mL·min^-1；检测波长：203nm；柱温：35℃。结果：人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的线性范围分别为0．077～1．537μg、0.058～1．156μg和0.078～1．563μg，相关系数均为0．9999。平均加样回收率（n=6）分别为98．3％，98．7％，99．2％；RSD分别为0．9％，1．0％，0．5％。结论：本方法具有快速、准确，重复性好等特点，适合于人参的含量测定。     

人参总皂苷对β-淀粉样肽致小鼠记忆障碍的影响

目的　研究人参总皂苷对 β 淀粉样肽 (β AP)所致学习记忆障碍的影响。方法　给小鼠一次性icv凝聚态 β AP活性片段 (2 5～ 35 ) 3μl (1 0mmol·L-1)造成早老性痴呆动物模型 ,采用避暗试验及Morris水迷宫试验 ,观察人参总皂苷对 β AP(2 5～ 35 )神经毒性的对抗作用。 结果　一次性icv凝聚态 β AP(2 5～ 35 )能导致学习记忆障碍。人参总皂苷(10 0 ,5 0 ,2 5mg·kg-1,ig)可明显改善 β AP(2 5～ 35 )所致被动回避性记忆障碍和空间记忆障碍。结论　人参总皂苷可对抗 β AP(2 5～ 35 )的神经毒性 ,改善 β AP(2 5～ 35 )引起的学习记忆障碍     

β-葡聚糖苷酶对三七皂苷-Fe的转化研究

目的本文首次报道利用工业酶制剂对三七皂苷-Fe进行酶转化的研究。方法从三七茎叶总皂苷中分离鉴定三七皂苷-Fe,利用工业酶制剂β-葡聚糖苷酶对三七皂苷-Fe进行转化。树脂法、硅胶柱层析及薄层层析法分离、纯化酶转化产物;1HNMR和13C NMR光谱数据分析鉴定酶转化产物Ⅰ是20(S)原人参二醇-20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→6)β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Mc);转化物Ⅱ是20(S)原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(C-K)。结果酶解动力学的研究中,经过24h的反应,三七皂苷-Fe的转化率接近95%。结论β-葡聚糖苷酶转化三七皂苷-Fe的途径为三七皂苷-Fe→人参皂苷-Mc→C-K。     

西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的制备及鉴定

目的 制备西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其酶活性与抗体活性。方法 采用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶进行共价交联。采用非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、比色法、间接免疫荧光法对偶联物进行鉴定并检测β-葡萄糖苷酶、西妥昔单抗的活性。结果 在电泳图上可分别见到β葡萄糖苷酶、西妥昔单抗、西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的清晰条带。比色法测定结果显示,西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L:672.97±46.19 vs869.50±57.28,t=5.972,P<0.05),但仍保持良好的酶活性。在荧光显微镜下可见到与偶联物共同作用的人膀胱癌EJ细胞带有红色荧光。结论 Sulfo-SMCC可成功将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶偶联,且偶联物仍能保持良好的酶活性与抗体活性。     

西洋参中人参皂苷Rg1人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量测定

［摘要］目的用快速分离液相色谱法分离测定西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。方法采用ZOBAX SB C18柱（4.6 mm×50 mm,1.8 μm）,流动相：乙腈（A） 0.1%磷酸（B）,梯度洗脱（0～25min,5%A→20%A;～35min,20%A→40%A）;流速：2.0 mL&#8226;min 1,测定波长：203 nm,柱温：35 ℃。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的线性范围分别为0.12～2.49,0.61～12.15,1.42～28.48 μg,相关系数分别为0.999 8,0.999 6,0.999 9;平均加样回收率（n=6）分别为97.8%,98.1%,98.3%;RSD分别为1.0%,0.8%,0.4%。结论该方法具有快速、准确、重复性好等特点,适合于西洋参的含量测定。     

两株具有将人参皂苷Rg1转化为人参皂苷F1活性的真菌鉴定

目的 对两株具有将人参皂苷Rg1转化为人参皂苷F1的真菌进行菌种鉴定.方法 通过菌落形态、产孢结构的观察及ITS-5.8S rRNA序列与Genbank中的rRNA序列进行同源比对,初步确定该两株菌的种属.结果 与结论 根据形态学特征及同源序列的比对确定菌株2246为菌核青霉(Penicillium sclerotiorum);菌株2367为Penicillium dipodomyicola.     

HPLC法测定通心络颗粒剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量

目的 建立通心络颗粒剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量测定方法.方法 采用C18柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,对制剂中人参皂苷Rg1、Re和Rb1进行定量测定,检测波长203nm,流速为1.2mL·min-1,柱温为30℃.结果 人参皂苷Rg1在1.835～18.350μg范围内与色谱峰面积呈线性关系;平均加样回收率98.3%;RSD为1.55%.人参皂苷Re在1.577～15.770μg范围内与色谱峰面积呈线性关系;平均加样回收率98.8%;RSD为1.71%.人参皂苷Rb1在2.334～23.336μg范围内与色谱峰面积呈线性关系;平均加样回收率101.8%;RSD为1.86%.结论 该方法准确度高,重现性好,应用性强,可作为该产品的质量控制方法.     

高效液相色谱法测定人参片中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量

目的:测定人参片中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量。方法:采用高效液相色谱法(HPLC法)。色谱柱选用HypersilC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400),检测波长为203nm。用外标法按峰面积计算回收率。结果:人参皂苷Rg1浓度在101.12～1011.20μg/mL(r=0.99968,n=5)范围内与峰面积呈良好线性关系,回收率为99.43%(RSD为1.07%);人参皂苷Re浓度在80.88～808.80μg/mL(r=0.99938,n=5)范围内与峰面积呈良好线性关系,其回收率为99.44%(RSD为11.23%)。结论:HPLC法操作便捷,测定结果准确,可用于人参片的含量测定和质量控制。     

拟人参皂苷F11抗阿尔茨海默病作用的Aβ相关机制

目的阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要病理特征为Aβ过度沉积形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结等。拟人参皂苷F11(PF11)是西洋参茎叶中分离提取的一种三萜皂苷化合物。我们前期研究结果显示,PF11具有拮抗东莨菪碱、D-半乳糖和LPS所致实验动物的认知障碍的作用,同时显著降低过度磷酸化Tau并减轻神经炎症,提示PF11可能通过干预AD发病的多种机制来实现改善认知障碍的作用。本文进一步评价PF11对AD模型动物认知功能障碍的改善作用,尤其对Aβ的产生及清除的相关机制。方法 (1) 6月龄和12月龄APP/PS1转基因小鼠灌胃给予PF11(8 mg·kg~(-1)),分别在给药3个月、1个月后进行行为学实验,并检测小鼠海马和皮质脑区中淀粉样蛋白前体蛋白(APP)及Aβ1-40的表达水平。(2)灌胃给予6月龄雄性SAMP8快速衰老小鼠PF11(2,8和32 mg·kg~(-1)),在给药3个月后进行行为学实验,并检测APP、β-分泌酶(BACE1)、晚期内含体Rab7和循环内含体Rab11的表达。(3)构建p EGFP-Rab5及p RFP-Rab7质粒并转染至原代小胶质细胞中,观察Rab转换。考察PF11对小胶质细胞吞噬、降解Aβ寡聚体(o Aβ)作用的影响,研究PF11对小胶质细胞内吞-自噬-溶酶体系统的保护作用。结果 (1) PF11给药可明显改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力,并可显著减少小鼠海马和皮质脑区中APP与Aβ1-40的表达水平。(2) PF11(8和32 mg·kg~(-1))可显著改善SAMP8小鼠的认知能力,显著减少小鼠海马和皮质脑区中Aβ的沉积,降低BACE1的表达水平,并可促进APP从细胞质向质膜的转运,提示PF11可能通过影响APP的剪切过程及亚细胞定位来减少Aβ的生成。此外,PF11(8和32 mg·kg~(-1))显著增加小鼠海马和皮质脑区中APP与Rab11的共定位,提示PF11可以促进APP与循环内含体结合从而减少Aβ的生成。(3) o Aβ可通过调节转录因子EB(TFEB)的核易位和延缓Rab的转化而阻碍溶酶体的自噬降解系统。PF11(30～100μmol·L-1)可通过促进自噬小体及内含体的成熟并恢复溶酶体功能,发挥促进小胶质细胞吞噬及降解Aβ的作用。结论 PF11可显著改善APP/PS1转基因小鼠、SAMP8小鼠的学习记忆障碍,同时减少小鼠海马和皮质脑区中Aβ的沉积。其机制与减少Aβ生成、促进其降解等多环节有关。     

固定化重组β-半乳糖苷酶对HIV抗体的变构分子传感

在固定化大肠杆菌β-半乳糖苷酶的变构反应的基础上，论证了定性及半定量测定HIV抗体的可行性。在先前的研究中已证实该重组酶的适用性与匀相测定法的条件。本研究确定了在活化的琼脂糖载体上固定化重组大肠杆菌β-半乳糖苷酶的操作条件，根据此方法制备了这种固相化酶，并研究了其性质，以测定在有HIV抗体存在时固定化酶的活化程度。