淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达

目的 扩增四株淋球菌外膜蛋白PI基因，构建pET30b-PI-NG重组子，在大肠杆菌中诱导表达外膜蛋白PI．方法 采集临床淋球菌四株，提取细菌基因组DNA，PCR扩增外膜蛋白PI基因，与克隆载体pBS-T连接，构建pBS-T-PI-NG重组子，测序，目的基因插入表达质粒载体pET30h中，构建pET30h-PING重组子，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白质表达，SDS-PAGE初步分析．结果 成功构建了四株淋球菌的pET30b-PI大肠杆菌表达重组子，经IPTG诱导表达后，其中三株获得表达的目的蛋白PI。结论 本研究为PI蛋白免疫学特性的研究、抗体制备、以及预防淋病疫苗的研制莫定了基础。     

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组的构建和表达

目的 构建脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组子,实现其在大肠杆菌的高效表达.方法 提取脑膜炎奈瑟菌标准株基因组DNA,PCR扩增NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c中,构建pET-NspA重组子,转化大肠杆菌BL21 (DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,镍琼脂糖凝胶纯化NspA 融合蛋白.结果 获得了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,得到NspA诱导表达蛋白并进行了初步纯化.结论 成功构建了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防脑膜炎的疫苗奠定了基础.     

淋球菌主要外膜蛋白PIA原核重组质粒的构建及序列分析

目的：构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因的pET重组质粒，分析其编码序列。方法：根据PIA已知序列设计——对引物，用PCR技术从淋球菌捷克标准株中扩增PIA；将目的基因PCR产物和质粒pET28a( )同时用BamHI和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，纯化回收后将其连接并将重组质粒转化大肠杆菌DH5α。将构建的重组质粒pET28a( )-PIA通过PCR、质粒双酶切、DNA测序证实获得正确的重组克隆。结果：成功构建PIA基因原核重组质粒pET28a( )-PIA。序列分析表明，其携带的PIA基因序列与GenBank中公布的淋球菌(AF090818)的PIA序列具有很高的同源性，其同源性达到99．9％。结论：成功构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因重组表达载体，有助于更深入地分析其基因功能，为后期淋球菌的临床检测和基因疫苗研制打下基础。     

淋球菌外膜蛋白的研究进展

淋病奈瑟菌是人类性传播疾病淋病的病原菌,简称淋球菌。主要引起泌尿生殖系统粘膜的急性或慢性化脓性感染。近年研究发现,淋球菌外膜蛋白在致病过程及宿主免疫反应中起着重要作用。淋球菌的感染率相当高,并可导致反复感染,这与其逃避宿主防御系统的机制较完善有关。菌体表面主要抗原成分外膜蛋白抗原等,     

幽门螺杆菌低分子质量外膜蛋白编码基因的克隆与重组载体构建

目的:构建幽门螺杆菌外膜蛋白编码基因重组载体,为的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础。18kDaHp方法:用从染色体中扩增外膜蛋白的编码基因片段,将目的基因、质粒同时经、Ⅲ双酶PCRHpDNA18kDapQE30BamHIHind切、纯化、连接、转染以及筛选含插入片段的重组载体。结果:经酶切、测序分析插入的基因片段为表达外膜蛋白Hp18kDa编码基因,有碱基发生变异,以及氨基酸残基改变。与文献相比有高度的同源性。2%1.68%,结论:外膜蛋白编码基因克Hp隆、重组载体的构建为该基因编码的蛋白质有效表达提供了条件,同时也为疫苗开发和快速诊断试剂盒的制备打下了基础。     

淋球菌孔蛋白PIB和PIA融合蛋白真核表达载体构建及体内表达

目的克隆淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因并构建融合蛋白真核表达质粒pCI-PIB-PIA,了解pCI-PIB-PIA能否被小鼠骨骼肌细胞摄取并表达。方法采用PCR方法从质粒pET-PIB和pET-PIA中获得孔蛋白PIB和PIA全长DNA片段,构建表达融合蛋白PIB和PIA的真核表达载体pCI-PIB-PIA。pCI-PIB-PIA肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ABC法检测pCI-PIB-PIA免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达。结果PCR可扩增出预期大小的全长PIB和PIA基因片段。与GenBank报道的PIB和PIA序列比较,重组质粒pCI-PIB-PIA中目的插入片段的核苷酸序列同源性达到99%以上。免疫小鼠的肌细胞能摄取pCI-PIB-PIA并表达PIB-PIA融合蛋白。结论本研究成功地构建了淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因重组真核表达载体pCI-PIB-PIA;pCI-PIB-PIA接种小鼠后可见免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达,该结果可作为淋球菌多价DNA疫苗的研究基础。     

淋球菌外膜蛋白Porin I多抗的黏附抑制作用研究

目的:研究兔抗淋球菌外膜蛋白Porin I(P I)的多克隆抗体阻断淋病奈瑟菌对泌尿生殖道上皮的黏附作用。方法:将自行构建表达的淋球菌GST-P I融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得兔抗P I蛋白的多抗血清,纯化后得到P I-IgG抗体。建立淋球菌感染BALB/c小鼠模型,并通过观察阴道黏膜改变、分泌物涂片、冲洗液培养及阴道组织病理变化评价兔抗P I-IgG抗体对淋球菌黏附的影响。结果:经1 m g/m l兔抗P I-IgG处理后3 h再接种淋球菌的BALB/c小鼠生殖道黏膜未见红肿及脓液,分泌物涂片及阴道冲洗液未检及淋球菌,阴道组织病理检查也未见炎症细胞浸润。而低于浓度1 m g/m l及长于3 h兔抗P I-IgG处理的小鼠阴道组织病理可检及炎症细胞,但其它检查结果阴性。结论:纯化的抗淋球菌GST-P I融合蛋白的多克隆抗体,能有效抑制淋病奈瑟菌对小鼠泌尿生殖道上皮的黏附与感染,阻断作用及持续时间与抗体浓度有关。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。     

赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达

目的 以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析.方法 以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化.筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物.分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性.结果 PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×10~3特异条带.体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究

目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。     

淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定

目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白（porinⅠB，PⅠB）的基因序列并表达相应的蛋白质，为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫卣的研究与开发建立基础。方法PCR扩增出孔蛋白PⅠBDNA片段后构建出重组质粒pET—PⅠB，并经质粒酶切筛选、DNA测序和异丙基硫-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导大肠埃希菌DE3表达蛋白予以证实。结果所得PⅠB核苷酸序列与GenBank（AF090801）公布的序列相比较，同源性达99．28％，推导氨基酸序列同源性为98．14％。SDS-PAGE检测到40kD大小的融合蛋白。结论淋病奈瑟菌孔蛋白PⅠB原核表达质粒构建正确。     

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定

目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A（nspA）基因原核表达系统，并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。方法采用PCR扩增nspA基因，构建nspA基因原核表达系统。SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况．Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA，免疫双扩散试验及WesternBlot鉴定rNspA的免疫原性。结果克隆的nspA基因与GenBank中相关序列相似性为100％，rNspA表达量为细菌总蛋白的40．1％，提纯的rNspA在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rNspA抗血清免疫双扩散效价为l：4，rNspA抗血清能有效识别rNspA。结论所构建的nspA基因原核表达系统能高效表达rNspA，表达的产物有良好的免疫原性，为淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基础。     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of mtrC Protein of Neisseria gonorrhoeae and Its Expression in E.Coli

Gonorrheais one of the most common venerealdiseases.The wild use of antibiotic againstNeisse-ria gonorrhoeaehas made the drug resistance a bigproblemin the prevention and treat ment of gonor-rhea.Besides the drug resistance mediated bychange in structure of penicillin-binding protein,mutation of DNAgyrase A,chromosome plasmid,another non-specificity multi-drug resistant mecha-nismofNeisseria gonorrhoeae,multiple transfera-ble resistance efflux system,has been paid closeattention to increasin…     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of Fusion Protein Including Porin A and Porin B of Neisseria Gonorrhoeae and Its Expression in E.coli

Neisseriagonorrhoeaeisacommonpathogenicmicroorganismwhichcausessextransmitteddisease .Therewereanestimated 6 0millionnew gonococcalinfectionsworld widein 1999.Theporins ,thepre dominantproteinsonthesurfaceofpathogenicNeis seria ,formafamilyofstructurallyr…     

Construtcion of Neisseria Gonorrhoeae Porin B Plasmid Recombinant and Its Expression in E.coli

Neisseria gonorrhoeaeis a common pathogenicmicroorganism which causes sex transmitted dis-ease . The porins ,the predominant proteins on thesurface of pathogenicNeisseria,form a family ofstructurally related proteins whose physiologicalrole is to allownutrients access into the cell . Theyalso play ani mportant role in pathogenesis ,gener-atingi mmunological specificity andinteracting withthe host cell .Neisseria gonorrhoeaeexpresses oneof the two alternative classes of porins PIA andPIB[1].…     

250株质粒介导的耐药淋球菌株的流行趋势分析

目的了解7年来广州地区质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势。方法用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MICs),筛选出质粒介导四环素耐药淋球菌(TRNG),以及用纸片碘量法测定质粒介导的产青霉素酶的淋球菌(PPNG)。结果846株淋球菌检出PPNG131株(15.5%)、TRNG184株(21.8%),7年来,PPNG、TRNG流行率经μ检验,P<0.01,有显著性差异。结论PPNG和TRNG流行率呈逐年上升趋势,持续监测质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势是十分必要的。     

淋病奈瑟菌检测技术研究进展

随着基因组学、现代分子生物学理论与技术的发展以及新仪器的研发,淋病奈瑟菌的检测方法将向快速、准确、灵敏、特异的方向发展,特别是PCR、ELISA等现代分子生物学技术的联用及实时PCR的进一步完善,大大提高了淋病奈瑟菌的检测质量和效率。     

淋病奈瑟菌porA基因实时荧光环介导等温扩增方法的建立

目的 运用实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速准确检测淋球菌的方法,以期用于淋病的早期临床诊断.方法 以淋球菌porA为靶基因,设计保守性和特异性良好的引物,以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性.结果 实时荧光LAMP法可检测到1 pg/μl(103CFU/ml)淋球菌基因组DNA,稳定性良好,其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增,porA引物对淋球菌高度特异,阳性结果15 min可快速检出.结论 成功建立了检测淋球菌porA的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法.     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of mtrC Protein of Neisseria gonorrhoeae and Its Expression in E. Coli

Summary： In order to provide a rational research basis for detection of resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimierobial hydrophobie agents and study on the resistant mechanism of multiple transferable resistance （mtr） efflux system, plasmid pET-28a（＋） encoding mtrC gene was constructed and the related target protein was expressed in Escherichia colt （E. cold DE3. The fragments of mtrC gene of Neisseria gonorrhoeae from the standard strains were amplified and cloned into prokaryotic expression plasmid pET-28a（＋） with restriction endonuelease to construct recombinant pET-mtrC which was verified by restriction endonuelease and DNA sequencing. The recom- binant was transformed into E. coli DE3 to express the protein mtrC induced by IPTG. The results showed mtrC DNA fragment was proved correct through restriction endonuelease and DNA sequencing. hs sequence was 99.5 % homologus to that published on GeneBank （U14993）. A 48.5 kD fusion protein which was induced by IPTG was detected by SDS-PAGE. It was concluded that the construction of prokaryotic expression plasmid of mtrC protein of Neisseria gonorrhoeae was correct and the fusion protein was successively expressed in E. coli.