3G-ELISA新方法在促肾上腺皮质素释素检测中的应用

目的:改进传统ELISA方法,提高其对痕量样本的检测灵敏度,降低检测限。方法:将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合,应用于传统ELISA方法,通过纳米材料的信号放大作用,提高对痕量样本的检测灵敏度,降低检测限。结果:优化后的方法可对浓度为0.02μg/mL的促肾上腺皮质素释素进行检测,灵敏度提高了125倍。结论:改进后的方法性能稳定,重复性好,可用于生物样本中痕量被检测物的测定。     

双信号放大的酶联免疫吸附测定新方法研究及应用

目的:在传统酶联免疫吸附测定法(ELISA)中引入纳米金和氧化石墨烯,以降低传统方法的检测限。方法:ELISA是根据抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记对受检物质进行检测的一种有效方法。本研究在传统方法的基础上,将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合,以提高ELISA对痕量样本的检测灵敏度,降低检测限。结果:优化后的方法可对0.02μg/m L的谷胱甘肽S转移酶(GST)进行检测,灵敏度提高了81倍,动态范围为0.02~1.62μg/m L。结论:改进后的ELISA性能稳定,重复性好,可用于生物样本中痕量物质的测定。     

基于原子转移自由基聚合反应的高灵敏度ELISA方法研究

目的:对传统酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行优化改进,以提高其检测灵敏度,拓展应用范围。方法:通过在传统ELISA方法中引入原子转移自由基聚合反应(ATRP)和纳米金颗粒(GNPs),并将大量辣根过氧化物酶(HRP)与二抗结合,提高了HRP与抗原的结合比例,进而实现了对待检测物的信号放大。结果:优化后的ELISA方法在对β淀粉样蛋白的检测中,检测限(LOD)降低为原来的1/81。结论:改进后的ELISA方法性能稳定,灵敏度大幅提高,能够用于对痕量目标检测物的检测。     

核酸定量检测试验应用于HIV-1感染实验室诊断的探讨

目的:探讨核酸定量检测在HIV-1感染实验室诊断中的应用。方法:选取145例第四代抗原/抗体联合诊断筛查试验为阳性反应的血浆样本,分别用Western印迹和HIV-1核酸定量方法进行检测,综合对比分析2种方法检测结果。结果:Western印迹检出阳性样本120例,不确定样本17例,阴性样本8例;HIV-1核酸定量试验检出结果大于检测限样本131例,其中包括12例Western印迹不确定样本、2例Western印迹阴性样本;有3例Western印迹阳性样本用HIV-1核酸定量检测试验未能检出。结论:核酸定量检测试验对于HIV-1感染阳性样本是一种有效的实验室诊断方法;对HIV-1核酸定量检测结果为"TND"的样本,建议加做Western印迹或结合其他补充试验结果进行综合诊断。     

抗胱抑素C鸡卵黄IgY抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价、高特异性的抗人胱抑素 C 鸡卵黄 IgY 抗体,并对其基本特性进行分析和鉴定.方法:以人胱抑素 C 为抗免疫产蛋的罗曼鸡,采用水稀释-盐析法提取及纯化 IgY 抗体,采用蛋白质定量、SDS-PAGE、West?ern 印迹和 ELISA 法对 IgY 抗体进行分析和鉴定.结果:免疫后14 d 即可从鸡冠血中检测出抗胱抑素 C 的特异性抗体,抗体效价在28 d 达最高峰(1∶32000),并可维持2个月以上;收集高效价时的免疫鸡蛋,制备鸡卵黄抗体 IgY;还性 SDS-PAGE 显示抗体 IgY 为相对分子质量分别为65×103和21×103的2条带,抗体纯度可达92%,得率为每个鸡蛋36.5 mg,抗体检出敏感度为15.63 ng/mL;Western 印迹证明该抗体具有高度特异性.结论:制备了抗胱抑素 C 的高效价、高特异性 IgY 抗体.     

评估国产（1,3）-β-D-葡聚糖检测试剂的诊断价值

目的比较国产与进口（1,3）-β-D-葡聚糖（BG）检测试验并对国产试剂在侵袭性真菌感染中的诊断价值进行评估。方法回顾性调查2008年4月～2009年5月我院203例（342份样本）怀疑侵袭性真菌感染的住院患者,根据诊断标准分为感染组和非感染组,对其中同时进行国产与日本试剂检测的100份样本进行配对t检验比较;在不同的判断标准下计算国产试剂的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等,采用McNemar配对χ2检验对不同方法进行比较。结果国产和日本试剂在感染组和非感染组配对t检验结果分别为P=0.235,P=0.076;国产试剂以单次≥20pg/mL和≥50pg/mL为界值的灵敏度、特异度分别为78.3%,67.2%和56.5%,85.0%,双次≥20pg/mL和≥50pg/mL为界值的灵敏度、特异度分别为25.0%,64.9%和25.0%,87.7%。结论国产与日本试剂检测值无统计学差异;国产试剂单次≥50pg/mL为界值较20pg/mL可以明显提高特异度,降低假阳性率,而不影响灵敏度。连续双份血清阴性（BG〈50pg/mL）具有较高的特异度和阴性预测值。     

伏马菌素B1对人外周血单个核细胞抗原加工相关转运子表达的影响

探讨伏马菌素B1(FB1)对体外培养的人外周血单个核细胞(hPBMC)抗原加工相关转运子(TAP-1)表达的影响。采用流式细胞定量检测(FCM)、免疫印迹(Western印迹)及半定量RT-PCR方法,研究不同浓度FB1(0,10和50μmol/L)处理后人外周血单个核细胞TAP-1在mRNA和蛋白质水平表达的影响。RT-PCR检测结果表明,10和50μmol/L FB1处理24h后,处理组细胞TAP-1mRNA明显低于对照组。在蛋白质水平,FCM定量分析表明,两个处理组细胞表面TAP1的平均荧光强度均较对照组降低,以50μmol/LFB1处理组降低显著(P<0.05)。免疫印迹结果亦表明,FB1处理组TAP-1的表达均较对照组降低。10和50μmol/LFB1可抑制体外培养的hPBMCTAP-1mRNA和蛋白质表达。     

4类葡萄球菌肠毒素的3种放大酶联免疫吸附测定技术的研究

葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒的主要致病蛋白质之一。目前由于对各类毒素检查方法的敏感性不太高(ELISA在1～10ng/ml),常常造成漏检。国内仅1篇文献报告采用BA-ELISA测定SEB的最低下限为0.38～1.5ng/ml,去年日本学者报道用BA-ELISA测定TSST的敏感性限30pg/ml。为了进一步提高对各类SE检测的敏感度,我们使用自制的兔抗SEA、兔抗     

一种新型免疫层析技术在临床乳腺癌Her-2蛋白定量检测中的应用

建立一种靶点蛋白质快速定量检测方法。在原有侧向流动免疫层析技术的基础上,通过优化层析材料和纳米微球的均一性、改进检测区的检测方法,经逐点扫描技术,建立标准浓度曲线,以达到对临床靶点蛋白质的定量检测。以乳腺癌组织中的Her2表达为例,通过对已知浓度样品的检测,验证本技术方法的准确度大于96%。另外,以蛋白质免疫印迹作为组织中特定蛋白质检测金标准,分析临床肿瘤组织中Her2蛋白的含量,其准确率也达到95.5%,而免疫组织化学方法检测准确率仅为69.58%。新型免疫层析法检测结果与靶向治疗患者的愈后密切相关(P<0.01)。改进后的新型免疫层析方法能够准确地对临床靶点蛋白质进行定量检测,而且结合侧向流动技术的简单、快速和易用性,这种新型检测方法可以广泛应用于临床组织标本、血液标本和体液标本中靶点蛋白质的临场定量检测,在一定程度上可以替代免疫组化技术。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的建立

玉米赤霉烯酮具有较强的生物毒性,检测谷物中的玉米赤霉烯酮在食品和饲料安全中具有重要的作用.将玉米赤霉烯酮与牛血清白蛋白的偶联物免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并建立基于单克隆抗体的酶联免疫法作为检测玉米赤霉烯酮的方法.结果共筛选到4株抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体,3株抗体亚类为IgG1,1株为IgG2b.选择其中的一株杂交瘤细胞2C9制备小鼠腹水,纯化后测定了抗体效价为1/40 000.以此单抗建立的间接竞争ELISA方法,其半数抑制率(IC50)为1.90 ng/mL,检测限(IC10)为0.051 ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.115-13.900 ng/mL;且对玉米赤霉烯酮有很好的特异性.回收率检测在样品含1.46-93.80 μg/kg时回收率为96.5％-113.0％.本实验建立的检测方法可用于多种谷物及饲料样本中玉米赤霉烯酮的检测.     

低浓度多聚甲醛固定对蛋白免疫印迹技术的改良

蛋白质免疫印迹（protein immunoblot,或Western blot）是一种广泛应用于检测细胞或组织蛋白质表达及蛋白质翻译后修饰的方法．前期的研究发现,使用低浓度（0.4%）多聚甲醛在蛋白质免疫印迹封闭环节前做膜固定,有助于提高蛋白质的检测效果．本文通过设置多聚甲醛的不同浓度和固定时间,进一步探索其在蛋白质免疫印迹技术中的应用．结果发现,低浓度（≤0.4%）多聚甲醛处理30 min,能明显提升蛋白质的检测效率．通过检测不同大小蛋白质的固定效果发现,大分子量的蛋白质使用多聚甲醛固定效果不明显,中等分子量和小分子量的蛋白质的固定效果较佳．综上研究表明,在中等或小分子量的蛋白质免疫印迹检测中,封闭环节前加入低浓度多聚甲醛固定,可以提高蛋白质的检测效果．     

中枢注射抗Orexin抗体对禁食大鼠摄食的抑制作用

目的:探讨中枢注射抗Orexin抗体对禁食大鼠摄食的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹分析法,对Orexin抗体的特异性进行了检测,分析Orexin阳性神经元和阳性神经纤维在大脑中的分布。给予24 h禁食大鼠中枢注射抗Orexin抗体,计算其对大鼠食物摄入量的影响。结果:蛋白质免疫印迹分析显示,Orexin抗体能够检测到合成的Orexin-A。免疫组织化学分析显示,Orexin阳性神经元存在于外侧下丘脑区域和穹窿周核,Orexin阳性神经纤维大量投射至弓状核、下丘脑室周核和下丘脑室旁核、菱形丘脑核、丘脑室旁核、缰内侧核和纹质丘脑、中脑的中央灰质区、蓝斑核和中缝核、脑桥和髓质的网状结构、对疑核和迷走神经复合体。与注射羊血清相比,给予45μg/10μL抗Orexin抗体侧脑室注射则抑制了大鼠的食物摄入量(P0.05)。高剂量抗Orexin抗体能显著地抑制大鼠摄食,并且呈剂量依赖关系(P0.05)。结论:中枢注射抗Orexin抗体对禁食大鼠摄食具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。     

蛋白免疫印迹法同时检测大、小分子蛋白的实验条件改进

目的:蛋白免疫印迹法是现代生物医学研究中广泛应用于蛋白定性和半定量分析的实验技术。然而,常规采用传统单一浓度凝胶的蛋白免疫印迹法在应用过程中仍有不足之处,如不能同时检测分子量很大和很小的蛋白,因而有必要探索一种增大凝胶有效分离范围的检测方法。本文提出采用组合凝胶来实现更大范围分子量蛋白的同时检测。方法:比较双浓度的组合凝胶与单一浓度凝胶的分离范围以及分析采用组合凝胶,蛋白免疫印迹法对大、小分子蛋白的检测效果。结果:12%/7.5%组合凝胶和15%/7.5%组合凝胶的分离范围显著大于相应的单一浓度凝胶。通过12%/7.5%组合凝胶,蛋白免疫印迹法同时检测到15-300 k Da范围内的大、小分子蛋白。结论:组合凝胶有助于蛋白免疫印迹法对分子量相差很大的蛋白进行同时检测分析,具有很强的实用性。     

β-TC3细胞膜与胰岛素受体结合G蛋白的鉴定

目的:用免疫共沉淀的方法检测β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞膜中与胰岛素受体结合的G蛋白.方法:提取β-TC3细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀及蛋白质印迹的方法,检测G蛋白α及β亚基的表达.结果:抗胰岛素受体抗体沉淀胰岛素受体结合的G蛋白复合物后,分别用抗胰岛素受体抗体、抗G蛋白α亚基抗体及抗G蛋白β亚基抗体,检测到胰岛素受体、G蛋白α亚基及G蛋白β亚基的表达.结论:在β-TC3细胞膜中,胰岛素受体与G蛋白共存,G蛋白α亚基及β亚基与胰岛素受体可能存在直接的相互作用.     

改进兔抗BCG血清的特异性以检测TB抗原

本研究以免疫印迹方法证实兔抗BCG与其它细菌抗原(金葡菌、表葡菌,克雷伯氏菌、大肠杆菌)的交叉反应,并以亲和吸附方法将金葡菌交叉反应抗体从市售抗BCG中加以去除。这样在检测脑脊液及其它样本中TB抗原时的假阳性率就可以降低,兔抗BCG的特异性将会增加。我们建立了竞争抑制的ELlSA方法,可以检测ng水平的分枝杆菌的抗原,     

HIV感染早期病毒p24蛋白的检测

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。     

番茄乙烯信号转录因子LeERF2多克隆抗体的制备

目的:作为番茄乙烯信号转录因子,LeERF2是在蛋白水平单独或同其他蛋白质协同与启动子或增强子相结合发挥其调控功能的,蛋白质的调控机制是信号转导领域中的关键研究内容。本研究目的是制备LeERF2抗体用于探讨番茄乙烯信号转录因子LeERF2在蛋白水平的生物活性及其生物学功能。方法:通过免疫新西兰大耳白雄兔和DEAE-52离子交换柱纯化分离制备了抗LeERF2多克隆抗体。结果与结论:抗体的效价大于10000,纯度达到了99%,Western印迹检测纯化后抗LeERF2多克隆抗体具有免疫特异性。     

基于磁性纳米微球的Gamma干扰素酶联免疫检测方法建立

目的：建立及评价使用磁性纳米微球作为固相载体的人酌干扰素（Interferon-gamma,IFN-gamma）双抗体夹心酶联免疫吸附实验 （Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法：以杂化细乳液合成法制备磁性纳米微球,将其作为免疫检测的固相 载体。将磁性微球与IFN-酌抗体进行偶联,建立基于磁性微球的ELISA 检测方法,检测人IFN-gamma,绘制IFN-gamma标准曲线并进行方法 学评价。结果：获得包被有人IFN-gamma抗体的免疫微球, 抗体偶联率为54.5 %。用它建立IFN-gamma的双抗体夹心的ELISA 检测方法,检 测范围为0-1000 pg/mL,相关系数为0.9996,灵敏度23.2 pg/mL,功能灵敏度0 pg/mL,批内和批间变异系数（Coefficients of Variance,CVs）＜8 %,检测总共需要2 小时。结论：成功制备了IFN-酌免疫微球并建立了定量检测人IFN-gamma的双抗体夹心磁珠 酶联免疫方法。     

基于纳米金核酸探针的新型试纸条对灿烂弧菌快速检测

灿烂弧菌Vibrio splendidus作为一种水产条件致病菌,可以感染多种水产养殖动物,给水产养殖业带来巨大的经济损失。文中将核酸外切酶Ⅲ酶切信号放大策略和纳米金标记DNA探针核酸试纸条相结合,建立了一种新型高效的灿烂弧菌检测方法,检测结果可凭肉眼直接判定,并突破了常规免疫试纸条单克隆抗体制备困难的障碍。经过实验条件优化,该核酸试纸条对灿烂弧菌人工合成寡核苷酸DNA片段的检测限是5 ng/mL,对灿烂弧菌基因组DNA实际样本的检测限是10 ng/mL,较PCR法灵敏度高,并对灿烂弧菌具有检测特异性。研究结果实现了核酸试纸条的快捷制备及对灿烂弧菌的高效检测,为水产病害的防治开辟了新的途径。     

hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠用于混合细胞中精子的分离与法医学鉴定

hLCN6 (Human lipocalin 6)是附睾特异性分泌蛋白,它能与精子结合,对精子的成熟发挥着重要作用。为了探究应用抗hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠技术分离混合细胞中精子的可行性,建立混合斑中精子细胞分离的新方法,制备了不同比例的精子-上皮细胞混合悬液及混合斑样本,以生物素标记的hLCN6单克隆抗体孵育样品,再用亲和素包被的免疫磁珠捕获分离精子细胞,提取精子DNA进行PCR-STR (Short tandem repeat)分型,同时以差异裂解法提取精子,比较两者的差异。经ELISA检测,hLCN6单克隆抗体与抗原的亲和力解离常数(Kd)为3.47×10~–9 mol/L。免疫印迹和免疫荧光结果显示,hLCN6在精子中可检测到,主要定位于精子头部的顶体后区域,但不能在上皮细胞中检测到。hLCN6抗体偶联的免疫磁珠复合物能够实现精子细胞的捕获和分离,显微镜观察显示免疫磁珠能够与精子头部特异性结合。对精子个数为10~3/mL的混合悬液,STR分型成功率(正确分型13个以上,RFU200)为90%。当精子数量≥10~4/mL时,分型成功率达10~0%;对精子数分别为10~3/mL、10~4/mL、10~5/mL的混合斑STR分型成功率分别为40%、90%和10~0%。综上,hLCN6抗体偶联免疫磁珠法可以有效分离混合细胞中的精子,分型成功率高于传统的差异裂解法。该方法简单高效,可作为性侵案件中法医混合斑检验的有效补充手段。