Tim-3、PD-1和CD28表达与慢性乙肝患者肝脏iNKT细胞功能的关系

目的研究慢性乙肝患者肝脏中恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞的功能与其表面Tim-3、PD-1、CD28表达的关系。方法无菌分离人体肝脏单个核细胞,建立α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)诱导慢性HBV感染后的iNKT细胞体外诱导扩增模型,以流式细胞术检测体外培养基线水平0 h和72 h的iNKT细胞的表面Tim-3、PD-1、CD28的表达以及IL-4、IFN-γ的分泌情况;用ELISA法检测培养上清中IL-4、IFN-γ的水平;阻断PD-1、Tim-3及活化CD28信号通路,以流式和ELISA法检测IL-4+iNKT与IFN-γ+iNKT。结果慢性乙肝患者(实验组)肝脏中的iNKT细胞的比例明显低于正常人(对照组)(P0.05);iNKT表面Tim-3、PD-1的表达明显增多(P0.05),而CD28的表达则明显减少(P0.05);iNKT细胞分泌IL-4、IFN-γ的功能明显降低(P0.05);单一α-GalCer刺激培养72 h后,实验组IL-4+iNKT、IFN-γ+iNKT的表达没有明显变化(P0.05),而阻断PD/PDL1、Tim-3/Tim-3L和(或)活化CD28/CD80信号通路后,IL-4+iNKT、IFN-γ+iNKT细胞的表达明显提高(P0.05)。结论慢性乙肝患者肝脏iNKT细胞功能存在明显的缺陷,并提示负向调控因子Tim-3、PD-1表达的增加和正向调控因子CD28表达的降低可能与iNKT细胞功能的下调密切相关。     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞毒性T细胞PD-1的表达研究

目的 检测慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中HBV特异性CD8 细胞毒性T淋巴细胞表面细胞程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)的表达情况.方法 采集慢性乙型肝炎患者外周血,直接离体情况下利用MHC-I-肽-五聚体技术标定HBV表位特异性细胞毒性T淋巴细胞以及荧光抗体标记细胞表面PD-1分子,经流式细胞仪检测分析.结果 在慢性乙型肝炎患者,HBV核心抗原18-27特异性CTL表达PD-1上调,达(79.0±12.5)%,显著高于总CD8 T细胞(27.7±14.8)%,以及CMV特异性CTL(20.6±5.9)%.结论 慢性乙肝患者HBV特异性CTL高表达PD-1分子,可能与慢性乙肝患者HBV特异性CTL功能低下密切相关.     

体外大量扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞及其生物学特性的初步分析

目的探讨体外大量培养扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的新方法,并初步研究其分子表型和功能特征。方法 20例手术切除的原发性肝癌组织经混合消化酶消化为单个细胞后,应用密度梯度离心法分离其中的淋巴细胞,然后应用两步培养法大量扩增TILs,并检测它们的生长扩增速度。应用流式细胞仪检测扩增淋巴细胞的分子表型,ELISA法检测其IFN-γ的分泌水平,并分析高表达PD-1和低表达PD-1分子TILs分泌IFN-γ的能力。结果 18例标本中的TILs在体外经两步法培养后可以扩增达到1010数量级。扩增的TILs中CD3~+细胞的比例为(91.7±7.4)%,CD3~+CD56~+细胞的比例为(28.5±11.7)%,CD3~+CD4~+细胞的比例为(32.5±19.6)%,CD3~+CD8~+细胞的比例为(62.5±29.1)%。PD-1分子在CD3~+CD8~+细胞的比例为(23.5±16.1)%。扩增的TILs分泌INF-γ的水平为(827.8±307.7)pg/ml,其中9例PD-1分子低表达的CD3~+CD8~+细胞的分泌INF-γ的水平为(1087.5±249.6)pg/ml,6例PD-1分子高表达的CD3~+CD8~+细胞的分泌INF-γ的水平为(478.6±69.3)pg/ml,两者相比有明显差异(P0.05)。结论应用两步培养法从原发性肝癌中大量扩增TILs简便易行,扩增的TILs主要为CD3~+CD8~+T淋巴细胞,且TILs中PD-1的表达与其分泌IFN-γ的能力呈负相关。     

肝癌患者外周血CD3~+T细胞和CD19~+B细胞中程序性死亡蛋白1(PD-1)及其配体表达水平增加

目的 观察肝细胞肝癌(HCC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中程序性死亡蛋白1(PD-1)和配体以及γ干扰素(IFN-γ)水平的变化。方法 采集15例早期HCC患者、13例进展期HCC患者和12例健康人(对照组)的外周血并分离PBMC。流式细胞术检测PBMC中PD-1、PD-L1和PD-L2的表达,ELISA检测血清中IFN-γ的水平,利用Pearson相关系数法和One-way ANOVA分析PD-1与IFN-γ的相关性。结果 进展期HCC患者外周血CD3+T细胞和CD19+B细胞中PD-1、PD-L1和PD-L2的表达水平和血清IFN-γ水平显著高于健康人群和早期HCC患者,HCC患者外周血CD3+T细胞和CD19+B细胞PD-1、PD-L1表达水平与IFN-γ呈正相关。结论 肝癌患者PBMC中PD-1、PD-L1和PD-L2分子表达增加,且PD-1、PD-L1与IFN-γ水平有关联。     

程序性死亡受体1/程序性死亡配体1信号各组分在急性冠脉综合征患者外周血中的表达及意义

目的 探讨程序性死亡受体1/程序性死亡配体1信号各组分在急性冠脉综合征(ACS)患者外周血中的表达及意义.方法 采用流式细胞术检测CD4+ CD28-T细胞表面程序性死亡受体1(PD-1)以及单核细胞表面程序性死亡配体1(PD-L1)的表达;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测外周血中可溶性程序性死亡受体1(sPD-1),可溶性程序性死亡配体1(sPD-L1)和干扰素-γ(IFN-γ)的浓度.结果 与稳定性心绞痛(SA)和正常对照组(HC)相比,ACS患者CD4+ CD28-T细胞表面PD-1和单核细胞表面PD-L1的表达明显上调(P＜0.05),外周血中sPD-1、sPD-L1和IFN-γ的水平显著升高(P＜0.05).其中,sPD-L1和IFN-γ的水平呈显著正相关(r=0.772,P＜0.05).sPD-1和IFN-γ的水平无相关性(r =0.306,P＜0.05).结论 ACS患者体内CD4+ CD28-T细胞过量产生的IFN-γ是单核细胞表面PD-L1表达上调和外周血sPD-L1水平升高的原因之一,为进一步研究CD4+ CD28-T细胞的增殖活化和防治ACS提供理论依据.     

慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素的表达与病毒载量的关系

目的 研究慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素(Perforin)、干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)表达与病毒消除的关系.方法 对50例慢性乙型肝炎患者外周血进行短期培养后,利用流式细胞术测定CD8~+细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达,并与30例正常对照进行比较;利用荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者HBV DNA的载量,分析其与CD8~+细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达的关系.结果 慢性乙型肝炎组CD8~+T细胞Perforin、IFN-γ和IL-10的表达分别为(5.30 ±2.62)%、(4.05±2.25)%和(0.77 ±0.50)%,明显低于正常对照组(t分别为4.50、4.56、4.20,P均<0.01);26例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞Pefforin和IFN-γ的表达分别为(4.54 ±1.93)%和(3.32 ±1.59)%,明显低于24例HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者(t分别为2.22、2.54,P均<0.05);慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞内Perforin和IFN-γ表达率与乙肝病毒DNA载量成负相关(r分别为-0.539、-0.340,P<0.01、P<0.05).结论 慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达减少,可能与慢性乙型肝炎患者病毒长期存在,病程迁延不愈有关.     

外周血CD4+CXCR5+滤泡辅助性T细胞与慢性乙型肝炎患者高球蛋白血症相关

目的 检测外周血CD4+ CXCR5+滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)的频率及其表面标志,分析与慢性乙型肝炎(乙肝)患者高球蛋白血症的关系.方法 收集健康人、乙肝患者及乙肝高球蛋白血症患者的外周血,分离血浆及外周血单个核细胞(PBMC),ELISA检测血浆中IL-21、CXCL13和IFN-γ水平,流式细胞术检测PBMC中CD4+ CXCR5+ Tfh细胞的频率及其表面PD-1、ICOS及CD40L的表达情况.结果 乙肝高球蛋白血症患者外周血CD4+ CXCR5+ Tfh细胞占CD4+T细胞的百分比(22.6±4.7)％明显高于普通慢性乙肝患者(11.9±3.9)％及健康志愿者(6.8±3.9)％,CD4+ CXCR5+ Tfh细胞上PD-1和CD40L的表达水平升高,血清IL-21及CXCL13水平升高,而IFN-γ水平降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 外周血CD4+ CX-CR5+ Tfh细胞与乙肝高球蛋白血症的发病相关.     

人外周血CD3~+CD56~+NKT与Vα24~+iNKT、Vβ11~+iNKT细胞的关系及NKT亚群和细胞因子分泌的研究

目的探讨正常人外周血中CD3+CD56+NKT细胞的频率与CD3+Vα24+iNKT、CD3+Vβ11+iNKT细胞之间的关系、表型特征及细胞因子的表达。方法应用流式细胞术,检测CD3+CD56+NKT细胞频率与CD3+Vα24+iNKT和CD3+Vβ11+iNKT细胞之间的关系、CD4及CD8表面分子及细胞因子的表达。结果正常人外周血CD3+CD56+NKT细胞的频率为6.39%±2.34%;只有1.5%CD3+CD56+NKT细胞表达TCRVα24和1.2%CD3+CD56+NKT细胞表达TCRVβ11,0.7%CD3+CD56+NKT细胞同时表达TCRVα24和TCRVβ11;根据CD4和CD8表面分子的表达,可将CD3+CD56+NKT细胞分为66.9%CD4+、20.4%CD8+和11.6%CD4-CD8-3个亚群;当细胞刺激后,50.2%CD3+CD56+NKT细胞分泌IFN-γ,3.3%分泌IL-4,1.5%同时分泌IFN-γ和IL-4。此外,CD4+NKT、CD8+NKT和CD4-CD8-NKT 3群细胞分泌IFN-γ的频率分别为45.1%、70.3%和55.4%,分泌IL-4的频率为6.5%、7.0%和6.9%,同时分泌IFN-γ和IL-4的频率为2.4%、4.7%和3.1%。结论大多数CD3+CD56+NKT细胞与CD3+TCRVα24+iNKT和CD3+TCRVβ11+iNKT细胞是不同的NKT细胞亚群,CD3+CD56+NKT细胞频率小,能分泌大量的细胞因子,参与机体的免疫反应。     

ICOS/ICOSL在类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的表达及临床意义

目的:检测初发类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)患者外周血淋巴细胞表面共刺激分子ICOS和ICOSL的表达,并探讨其临床意义。方法:采用流式细胞术和RT-PCR的方法,检测85例初发RA患者和50例健康对照(Healthy control,HC)外周血CD4+T细胞表面ICOS及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面ICOSL的表达,比较15例初诊RA患者治疗前后ICOS和ICOSL表达水平变化,分析其临床意义。结果:RA患者外周血中ICOS/ICOSL的mRNA的表达水平显著高于HC。RA患者外周血CD4+T细胞表面ICOS表达显著增高[(7.08±4.72)%vs(3.01±1.39)%,P0.0001]。RA患者外周血中CD14+单核细胞[(5.77±3.45)%vs(3.64±1.43)%,P0.05]和CD19+B细胞[(5.78±4.52)%vs(3.97±1.63)%,P0.05]表面ICOSL的表达均高于HC。活动期的RA患者外周血单核细胞和B细胞表面的ICOSL表达高于非活动期患者[(5.45±3.50)%vs(4.04±1.55)%,P=0.036]、[(6.59±5.74)%vs(5.63±4.30)%,P=0.016],治疗后CD4+T细胞表面ICOS的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面ICOSL的表达均显著下降[(3.33±0.31)%vs(5.56±1.11)%,P=0.076]、[(5.12±1.23)%vs(9.99±2.02)%,P=0.045]、[(3.74±0.57)%vs(8.62±1.77)%,P=0.011]。结论:RA患者外周血单个核细胞表面ICOS和ICOSL异常高表达,且与疾病活动度和临床疗效密切相关。提示ICOS/ICOSL信号通路可能参与RA免疫病理进程。     

日本血吸虫感染小鼠的脾脏CD8+PD-1+T细胞的功能特性

目的研究日本血吸虫感染后小鼠脾脏CD8+PD-1+T细胞含量及功能的变化情况。方法使用日本血吸虫感染5～6周的C57BL/6小鼠,分离脾脏,制备石蜡切片,HE染色,观察组织病变情况;分离淋巴细胞并计数,运用流式细胞术检测CD8+PD-1+T细胞的含量;使用细胞表面染色的方法观察CD8+PD-1+T细胞的CD25、CD69、CXCR5、CD40L的表达变化;经PMA和离子霉素的刺激,使用细胞内细胞因子染色的方法检测IFN-γ、IL-10和IL-12的分泌情况。结果日本血吸虫感染后,小鼠体质量下降(P0.05),而脾脏质量和体积均明显上升(P0.01);脾脏中CD8+PD-1+T细胞的比例和绝对值数目增加(P0.01);感染组CD8+PD-1+T细胞高表达CD69(P0.05),而感染组CD8+PD-1+T细胞CXCR5分子表达显著下降(P0.05);经PMA与离子霉素刺激以后,CD8+PD-1+T细胞IFN-γ分泌增加(P0.05)。结论血吸虫感染5～6周小鼠脾脏中CD8+PD-1+T细胞为一群主要的活化细胞群可大量分泌IFN-γ,在血吸虫感染疾病发挥重要的免疫调节作用。