两种非接触共培养方法诱导山羊BMSCs向成软骨细胞分化的实验研究

【摘要】 目的 本文探讨利用两种非接触共培养方法诱导山羊骨髓基质干细胞（Bone marrow stem cells,BMSCs）向成软骨细胞分化的方法和可行性。方法山羊髂后上棘穿刺取骨髓进行BMSCs的培养、扩增、鉴定,软骨细胞取自山羊的最后一根肋骨游离缘,采用Transwell共培养板法和三维立体共培养方法进行非接触共培养,Transwell 共培养板法共培养分三组,分别为BMSCs不诱导组、BMSCs仅由成软骨诱导培养液诱导组和BMSCs经transwell板共培养诱导组。三维材料中立体非接触共培养法分为24孔板底有软骨细胞的实验组和无软骨细胞的对照组,负载BMSCs的PLGA材料悬浮在24孔板中。在第3周分别通过甲苯胺蓝染色（Toluidine blue staining）、阿利新蓝染色（Alican blue staining）、II型胶原免疫荧光（collagen II immunofluoresence）、II型胶原免疫组化（collagen II immunochemical staining）进行组织学鉴定,在第2周进行collagen II、COL2a Q-PCR进行成软骨的鉴定,同时做collagen I 和osteopontin的QPCR检测成骨基因表达。结果 从山羊髂后上棘分离出的细胞增殖迅速,第四代时鉴定表明所获取的细胞具有干细胞特征。软骨细胞增殖至第三代时形态去分化表现不明显。甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫荧光及PCR结果显示两种共培养方法诱导的BMSCs均有成软骨表现,在Transwell板共培养法时共培养诱导BMSCs成软骨效果稍弱于成软骨诱导液,无论是成软骨诱导液组还是共培养组都发现成骨基因osteopontin表达也有上调 。结论 采用两种非接触共培养方法均能促进山羊BMSCs向成软骨细胞分化,但是Q-PCR提示存在成骨风险。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性。方法 将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20％上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照。各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价。结果 各组细胞均与材料粘附良好。8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌。9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织。阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝。低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组。结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20％浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果。     

骨形态反应蛋白-2对骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养向软骨细胞分化的影响

目的研究细胞因子骨形态反应蛋白-2(BMP-2)与软骨细胞共同诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化是否有协同作用,并检测BMP-2对BMSCs和软骨细胞共培养诱导分化为软骨细胞的最佳浓度。方法将体外分别培养扩增的兔BMSCs和软骨细胞按相同的比例(7∶3)混合后,均以5.0×107.mL-1的细胞浓度接种混合培养,根据不同的BMP-2浓度分为以下几组,5、10、20、30、40、50 ng/mL组,以单独培养的软骨细胞作为阳性对照组,以单独培养的BMSCs作为阴性对照组,以混合培养后不加BMP-2作为0 ng/mL组。通过MTT、Ⅱ型胶原蛋白表达以及糖胺聚糖蛋白表达的检测,确定BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs是否有协同作用及促进BMSCs向软骨细胞转化的最佳BMP-2浓度。结果单独培养BMSCs的阴性对照组向软骨细胞分化的倾向不明显,而与软骨细胞混合培养的0 ng/mL组软骨细胞增多,添加BMP-2的5、10、20、30、40、50 ng/mL组向软骨细胞分化更加明显。结论 BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs对于其向软骨细胞分化有协同作用,BMP-2的最佳作用浓度为20 ng/mL。     

骨髓间质干细胞体外与阿霉素损伤的心肌细胞共培养时的定向分化

目的：研究兔骨髓间质干细胞(menseuchymal stem cells，MSCs)在体外以不同方式与阿霉素损伤后的仔鼠心肌细胞共培养时的定向分化情况，为心肌病细胞移植治疗提供基础．方法：体外分离培养兔骨髓间质干细胞，经5-氮杂胞苷诱导和DAPI标记后，与阿霉素预处理的乳鼠心肌细胞一起共培养，分别在共培养后的第14，21，28日，采用透视电镜观察超微结构，免疫细胞化学方法鉴定，并用流式细胞仪检测α-sareomeric actin阳性或DAPI和Cy3双阳性细胞所占百分比．取仅经5-氮杂胞苷诱导的的骨髓间质干细胞作为对照组．结果：21，28d时Millicell组和对照组可见小部分α-sareomeric actin、desmin阳性细胞，直接接触组内DAPI标记的MSCs细胞部分免疫荧光反应阳性．电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央，胞质中可见富集的糖原颗粒．流式细胞仪检测结果示直接接触组中双阳性细胞百分比高于其余两组．结论：骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞，在体外病理性心肌细胞微环境中可顺利分化为心肌样细胞．同细胞液因子相比，细胞间的直接接触对MSCs的定向分化有更重要的促进作用，MSCs可与周围的心肌细胞形成某种连接．MSCs可能成为细胞移植治疗心肌病的一种新的细胞来源．     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

软骨细胞上清液诱导骨髓间充质干细胞分化的软骨细胞的形态学及功能检测

摘 要］目的：应用家兔肋软骨细胞上清液诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞定向分化,并对分化的细胞进行形态学和功能检测,探讨MSCs在体外成软骨分化的条件。方法：分离家兔的MSCs和肋软骨细胞进行体外培养,收集前3代肋软骨细胞上清液作为诱导液,对第3代MSCs进行14 d的诱导培养。设置实验组、阳性对照组和阴性对照组,观察各组细胞的形态,甲苯胺蓝染色观察特异性蛋白表达、各组ALP活性,RT-PCR法检测各组细胞中的Ⅱ型胶原(ColⅡ) mRNA的表达。结果：经过14 d的诱导培养,实验组MSCs由长梭形逐渐变成多角形,甲苯胺蓝染色呈阳性;ALP活性显著升高,与其他2组比较差异有统计学意义(P＜0.01）;ColⅡ mRNA表达呈阳性。阴性对照组甲苯胺蓝染色呈阴性,ColⅡ mRNA表达呈阴性。阳性对照组甲苯胺蓝染色呈阳性,ColⅡ mRNA表达呈阳性。结论：家兔肋软骨细胞上清液能够促进MSCs向软骨细胞方向分化。     

山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化

目的 探讨体外分离、培养山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),并将其诱导分化为软骨细胞表型,明确其向软骨细胞分化的能力.方法 抽取10月龄健康中国青山羊骨髓,贴壁法培养BMSCs,体外培养至第4代时进行流式细胞术鉴定,并加入成软骨诱导培养基,其成分包括10% FBS高糖DMEM培养基、6.25 μg/ml 胰岛素、6.25 μg/ml 转铁蛋白、50 μmol/ml抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1.分别于0、1、2、4周行细胞化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹试验(Western blot)检测II型胶原和Aggrecan的表达.结果 山羊BMSCs生长良好,传至第4代时细胞纯度较高.加入诱导培养基后,山羊BMSCs在1、2、4周均可看到软骨细胞表型的表达,并且随着时间的延长,其II型胶原及Aggrecan基因和蛋白的表达量逐渐增加,2周时即可达到较好的诱导效果.结论 本实验采取一种简易的方法 分离、培养并向软骨细胞方向诱导分化山羊BMSCs,证实其具有分化为软骨细胞的潜能,为山羊用于骨软骨组织工程的体内研究提供了实验基础.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

目的：建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供更完善的方法。方法：采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色（ALP染色）;利用Percoll 梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs 免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）进行鉴定。结果：体外分离、培养的hMSCs具有独特的细胞免疫学表型, 即CD73和CD105阳性, CD34和CD45 阴性。hMSCs与成骨细胞共同培养5 d后,即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP 染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱导成功的破骨细胞。结论：hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

人纤维环细胞与骨髓间充质干细胞Transwell共培养研究

目的探讨人的纤维环（AF）细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）在Transwell共培养后,对AF细胞的细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及BMSCs是否具有向AF细胞分化的能力。方法分别对5例年龄在40岁以下脊柱手术患者的纤维环组织和骨髓标本进行分离、培养AF细胞和BMSCS,分别吸取第三代的AF细胞和BMSCs,按1 1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入BMSCs,上室植入AF细胞。并且建立3个细胞培养组,即BMSCs与AF细胞共培养组（实验组）,BMSCs单独培养组和AF细胞单独培养组作为对照组。培养3周后,运用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;分别用HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和流式细胞仪对两种细胞鉴定;运用荧光定量PCR法检测各细胞培养组蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达变化。结果两种细胞在分离培养后经过鉴定确定为AF细胞和BMSCs。在倒置相差显微镜观察下,共培养组中AF细胞和BMSCs在细胞增殖数量和速度上均高于各自的单独培养组;共培养组中AF细胞和BMSCs的蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达均较各自的单独培养组高（P〈0.05）。结论通过BMSCs与AF细胞Transwell共培养,BMSCs可以促进AF细胞增值和细胞外基质的合成;同时通过共培养,BMSCs具有向AF细胞分化的可能。     

Osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells regulated by osteoblasts under EMF exposure in a co-culture system

This study examined the osteogenic effect of electromagnetic fields （EMF） under the simulated in vivo conditions. Rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） and rat osteoblasts were co-cultured and exposed to 50 Hz, 1.0 mT EMF for different terms. Unexposed single-cultured BMSCs and osteoblasts were set as controls. Cell proliferation features of single-cultured BMSCs and osteoblasts were studied by using a cell counting kit （CCK-8）. For the co-culture system, cells in each group were randomly chosen for alkaline phosphatase （ALP） staining on the day 7. When EMF exposure lasted for 14 days, dishes in each group were randomly chosen for total RNA extraction and von Kossa staining. The mRNA expression of osteogenic markers was detected by using real-time PCR. Our study showed that short-term EMF exposure （2 h/day） could obviously promote prolifera- tion of BMSCs and osteoblasts, while long-term EMF （8 h/day） could promote osteogenic differen- tiation significantly under co-cultured conditions. Under EMF exposure, osteogenesis-related mRNA expression changed obviously in co-cultured and single-cultured cells. It was noteworthy that most osteogenic indices in osteoblasts were increased markedly after co-culture except Bmp2, which was increased gradually when ceils were exposed to EMF. Compared to other indices, the expression of Bmp2 in BMSCs was increased sharply in both single-cultured and co-cultured groups when they were exposed to EMF. The mRNA expression of Bmp2 in BMSCs was approximately four times higher in 8-h EMF group than that in the unexposed group. Our results suggest that Bmp2-mediated cellular interaction induced by EMF exposure might play an important role in the osteogenic differ- entiation of BMSCs.     

自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复 五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋软骨细胞(costal chondrocytes,CCs)共培养构建组织工程软骨及共培养细胞修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的可行性,为临床修 复关节软骨缺损提供理论依据和奠定实验基础。方法：密度梯度离心法分离五指山小型猪BMSCs,双酶消化法分离 CCs。取第3代BMSCs和第2代CCs,随机分为3组：BMSCs:CCs为1:2的共培养组为A组,单纯CCs为B组,单纯BMSCs 为C组。绘制细胞生长曲线图,测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)的能力。将12只五指山 小型猪随机分为共培养细胞/胶原膜实验组、胶原膜对照组和空白组。共培养细胞/胶原膜实验组髁间窝软骨缺损处 植入共培养细胞/胶原膜,胶原膜对照组单纯植入胶原膜,空白组不做任何植入,于术后第8和16周分别处死6只动 物,每组2只。取材行大体观察、软骨组织学评分及病理组织学检测。结果：密度梯度离心法分离的BMSCs生长良 好,双酶消化法分离的CCs生物活性良好,共培养细胞生长良好。术后16周共培养细胞/胶原膜实验组修复组织呈透 明软骨样,表面光滑平坦,周围软骨及软骨下骨整合良好,而胶原膜对照组和空白组为纤维性修复和无修复。共培 养细胞/胶原膜实验组修复组织大体评分明显优于胶原膜对照组和空白组(均P<0.05),胶原膜对照组和空白组之间差 异无统计学意义(P>0.05)。结论： BMSCs,CCs和共培养细胞均适合作为软骨组织工程的种子细胞,其中共培养细胞 (BMSCs:CCs为1:2)更具优势;共培养细胞复合胶原膜修复软骨缺损近期效果满意。     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

骨髓间充质干细胞二维培养条件下向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨二维培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为软骨细胞的方法.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSC,取第4代BMSC行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1、5、10、15和20ng/mL的TGF-β1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代BMSC诱导培养,2周后采用免疫组化法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝(DMB)比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖(GAG)的表达情况.结果 贴壁培养法可分离并纯化sD大鼠的BMSC,所得第4代BMSC细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组化染色显示TGF-β15、10、15和20ng/mL组阳性,二甲基亚甲蓝(DMB)比色法检测显示实验组细胞外基质糖胺多糖(GAG)含量均明显增加(P<0.00),其中TGF-β110 ng/mL组细胞分泌的GAG显著多于其他剂量组(P<0.00).细胞分泌GAG的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论 贴壁培养法可以获得较纯的BMSC,该实验所用的诱导体系可成功将BMSC诱导为软骨细胞;TGF-β110ng/mL组诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力强于其他剂量组,在该实验的细胞密度范围内其诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力与细胞密度呈正相关.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的 评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度.方法 分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化.制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5 cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况.结果 成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P＜0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)％,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加.结论 脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料.当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL.     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.