Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备简

 目的 原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法 将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论 成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。     

HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体, ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40 000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论 HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。     

人前蛋白转化酶枯草溶菌素9的cDNA克隆和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体并诱导其表达,制备其蛋白的多克隆抗体.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列;扩增产物经TA克隆、双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化人大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,诱导表达;用纯化检测过的目的蛋白免疫新西兰兔,最后采集全血收集血清,获得多克隆抗体,并对该抗体进行免疫印迹及效价测定.结果 PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功,用诱导表达的目的蛋白免疫动物,收集血清获得多克隆抗体.对多克隆抗体进行纯化,免疫印迹检测结果证明自制多克隆抗体特异性良好,效价测定为1∶13 200.结论 成功构建了pcsk9原核表达载体pET-28b-pcsk9,且获得了其蛋白的多克隆抗体.     

大鼠抗人表皮生长因子受体3(ErbB3)二聚化界面区多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备由人表皮生长因子受体3(ErbB3)二聚化界面区第236至308位氨基酸肽段(ErbB3Ⅱ)与麻疹病毒蛋白第288至302位氨基酸肽段(MVF)连接而成的融合蛋白MVF-ErbB3Ⅱ,并制备和表征其大鼠多克隆抗体。方法化学合成法合成MVF-ErbB3Ⅱ的基因,利用DNA连接酶与pET-21b载体连接成重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)进行MVF-ErbB3Ⅱ原核表达,MVF-ErbB3Ⅱ经镍离子亲和层析法纯化后,免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体滴度,Western blot法、免疫共沉淀法(IP)和流式细胞术鉴定抗体特异性和靶向性。结果 SDS-PAGE证实大肠杆菌成功表达了MVF-ErbB3Ⅱ蛋白,ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体效价,Western blot法、IP和流式细胞术结果表明多克隆抗体具有良好的MVF-ErbB3Ⅱ及非变性ErbB3特异性和二聚化界面靶向性。结论成功进行了MVF-ErbB3Ⅱ原核表达和分离纯化及大鼠抗MVF-ErbB3Ⅱ多克隆抗体的制备和表征。     

转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白基因克隆、表达、抗体制备及应用

目的:克隆转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,表达纯化TccP,制备其多克隆抗体并研究该抗体在EHEC O157:H7黏附宿主细胞模型中的应用.方法:从EHEC O157:H7 Sakai菌株基因组中克隆得到tccP基因,构建重组表达质粒pET28a-TccP.将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体,并用ELISA法和Western blot法对其进行鉴定.使用兔抗TccP多克隆抗体对EHEC O57:H7黏附宿主细胞模型中的TccP分子进行定位研究.结果:获得了TccP cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-TccP;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了相对分子质量(Mr)约37000的目的蛋白.表达产物N端氨基酸序列测序结果与GenBank公布的基因序列推定的氨基酸序列完全一致.所制备的兔抗TccP多克隆抗体经Westem blot法测定可与Mr37000目的蛋白发生特异性结合反应;免疫荧光检测发现TccP聚集在EHEC O157:H7 黏附处细胞膜的下方.结论:成功构建了pET28a-TccP载体,获得了高纯度的重组TccP及其特异性多克隆抗体.     

蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。     

5-氟尿嘧啶多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备5-氟尿嘧啶(5-FU)免疫原并制备其多克隆抗体。方法采用化学合成法对5-FU进行修饰制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸半抗原(5-FUAA),并经碳酰二亚胺盐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接以制备免疫原。采用5-FU与BSA结合的免疫原(5-FUAA-BSA)免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,5-FU与OVA结合物(5-FUAA-OVA)包被酶标板经间接ELISA检测抗血清效价,并采用ELISA与Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功合成半抗原5-FUAA,并分别制备5-FUAA-BSA和5-FUAA-OVA完全抗原。将5-FUAA-BSA免疫BALB/c小鼠制备的免疫血清效价达1∶1 280 000,且该多克隆抗体能特异地结合5-FU半抗原。结论成功制备了5-FU的多克隆抗体。     

兔抗人copine-8蛋白多克隆抗体的制备

目的制备人源copine-8(CPNE8)蛋白的多克隆抗体。方法反转录PCR扩增HBE人支气管上皮细胞的CPNE8基因(编码CPNE8蛋白)并克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,所得的重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化目的蛋白并基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。以纯化的CPNE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法检测抗体的效价和特异性。结果成功构建了p GEX-4T-1-CPNE8表达载体,重组CPNE8蛋白在大肠杆菌中高效表达。ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶64 000;此多克隆抗体可经Western blot特异性识别原核表达的CPNE8蛋白,并可适合免疫组织化学技术检测该蛋白在人正常肺组织和肺癌组织中的分布。结论成功制备具有较好结合特异性的CPNE8蛋白多克隆抗体。     

肿瘤脱落抗原

目前已经建立了一些肿瘤抗原单克隆抗体(McAb)制剂。这些肿瘤抗原包括:癌胚抗原(CEA),甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素。经证实,单克隆抗体CEA测定法的敏感性可以与多克隆抗体相媲美,而其特异性明显高于多克隆抗体。目前已有人对用单克隆制剂鉴定新的肿瘤标志(CA19-9,CA125,MAM-6,DF3和B72.3)特性及临床意义进行了讨论。     

sH-2Kd肽复合物的构建及多克隆抗体的制备

目的 构建可溶性的H-2Kd肽复合物,并制备抗MHC-I(H-2Kd)分子多克隆抗体.方法 原核高效表达的sH-2Kd-BSP和β2m蛋白,在抗原肽(乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc131-139)的存在下,体外复性折叠成可溶性的H-2Kd-β2m-抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体.应用纯化的该复合物单体免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体.结果 ①Western blot检测显示获得了生物素化的sH-2Kd-HBe复合物单体.②Western blot检测显示抗MHC-I(H2Kd)分子多克隆抗体与复合物单体有很好的抗原抗体反应;Balb/C小鼠脾脏冰冻切片的免疫组化结果:在细胞膜表面见棕色着色.③Dot-ELISA检测该多克隆抗体的滴度可以达到1:3 200.结论 成功构建了具有完整构象的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,制备了抗MHC-I(H-2Kd)分子多克隆抗体.     

HIV-1 p15(Gag)基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的 为了研究HIV-1 p15(Gag)的生物学活性,制备HIV-1 p15(Gag)蛋白及其特异性抗体.方法 用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的 蛋白.以纯化目的 蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达载体pET28 a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约20000的p15(Gag)蛋白经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论 得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.     

果蝇再生蛋白(rgn)多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备具有高度特异性的抗果蝇再生蛋白(rgn)的多克隆抗体。方法利用PCR技术从果蝇W1118c DNA中获得rgn基因片段,构建重组质粒;将其转入JM109(DE3)菌株中诱导rgn融合蛋白表达,再利用Ni-NTA superflow层析柱法将其纯化;经Western blot法检测后,利用制备的抗原免疫SD大鼠,从血清中获得高纯度的抗rgn多克隆抗体,利用Western blot法和免疫组织化学染色法对抗体特异性进行鉴定。结果构建的pRSETA-rgn表达载体成功表达6×His-rgn蛋白,融合蛋白在大肠杆菌中大量表达并纯化后,作为抗原免疫SD大鼠,获得了抗rgn的多克隆抗体;免疫组织化学染色技术证实rgn定位在果蝇三龄幼虫血细胞的细胞质。结论成功获得了特异性较高的大鼠抗rgn多克隆抗体。     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

目的:制备抗耻垢分枝杆菌(Smeg)GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29b-SmegglmU,用IPTG诱导表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗Smeg GlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以Western blot方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU;以其免疫小鼠获得抗血清,Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体,ELISA测定表明其效价高于1:6 400.结论:获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体,为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础.     

生殖支原体粘附素蛋白MgPa的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

目的:制备并纯化生殖支原体(Mg)粘附素蛋白(MgPa)的多克隆抗体,为进一步探讨MgPa的生物学功能及其在Mg的临床诊断与预防方面的应用提供实验基础。方法:构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达生殖支原体粘附素蛋白(rMgPa′),重组蛋白经Western blot鉴定后用Ni-NAT亲和层析柱纯化,然后免疫新西兰兔以制备兔抗rMgPa′血清。用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化多克隆抗体,并经Western blot鉴定免疫血清的特异性,用间接ELISA法检测免疫血清的效价。结果:在大肠杆菌中成功表达一分子量约为37kD的6×His-rMgPa′融合蛋白,免疫新西兰兔后获得了相应的多克隆抗体,利用饱和硫酸铵法和亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的多克隆抗体,SDS-PAGE分析的结果表明所制备的多克隆抗体分子量约为150kD,Western blot结果表明制备的抗体具有较高的特异性,ELISA结果显示抗体的效价为1∶25600。结论:成功制备了高效价、高特异性的兔抗rMgPa′的多克隆抗体,为进一步研究MgPa的生物学功能、Mg的临床诊断与预防提供了重要的实验基础。