PRL-2基因转染对肝细胞基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的影响

目的:研究PRL-2基因增强肿瘤细胞侵袭及转移能力的机制。 方法:采用脂质体转染的方法将PRL-2基因表达质粒转染至正常永生化肝细胞系CL1中，G418筛选阳性克隆。应用明胶酶谱法检测转染肝细胞分泌MMPs 酶谱变化，Western blotting 及RT-PCR检测转染肝细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的变化。以PRL-2磷酸酯酶特异性抑制剂处理转染细胞，观察抑制PRL-2活性对上述指标的影响。 结果:经过 8周G418筛选及RT-PCR和Western blotting鉴定,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1。转染后的CL1细胞分泌MMP－9 、活性型MMP－9 和MMP－2 ,均显著高于转染前CL1细胞的MMPs 分泌(P<0.01);使用特异性抑制剂后， MMP－9 、活性型MMP－9 和MMP－2活性显著降低(P<0.01)。Western blotting及RT-PCR检测显示PRL-2-CL1细胞MMP2、MMP9蛋白及mRNA含量均较转染前显著升高(P<0.05)，TIMP-2则显著降低(P<0.05)；使用抑制剂后，可以逆转上述变化。 结论:PRL-2在永生化肝细胞中获得稳定、高效表达，PRL-2基因增强肝细胞侵袭及转移能力与其提高细胞MMP2、MMP9表达，降低TIMP-2有关。     

人细胞周期蛋白H基因的真核表达载体构建和表达及功能检测

<正>细胞周期蛋白H(cyclin H)是一种含323个氨基酸,相对分子质量(Mr)为38 000的细胞周期调控蛋白,普遍存在于真核细胞中,可与细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)共同参与细胞周期和基因转录的合理调控,其复合体可以催化各种CDK分子的活化,从而影响细胞增殖[1]。Cyclin H可催化多种CDK(如CDK2、CDK4、     

人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 探讨腺病毒介导人生长终止特异性同源异型盒基因(hGax基因)转染对血清刺激后兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和细胞周期的影响,为静脉桥再狭窄基因治疗新策略提供帮助。方法: 构建含 hGax 的重组腺病毒载体并感染兔VSMCs;应用RT-PCR、免疫荧光染色检测hGax mRNA和蛋白的表达; MTT法观察hGax基因过表达对血清刺激后VSMCs增殖的影响;划痕法测定细胞迁移;流式分析细胞周期。结果: 成功构建Ad5-hGax重组腺病毒载体。转染48 h后 RT-PCR和免疫荧光染色法示转染 hGax 基因的VSMCs中存在目的基因特异性片段(174 bp)和目的蛋白表达;MTT法示hGax蛋白显著抑制血清刺激后VSMCs增殖;划痕法示hGax基因过表达明显抑制血清刺激后VSMCs迁移;流式结果示血清刺激72 h后,Ad5-hGax转染组G₀/G₁期细胞比例明显增加,G₂/M+S期细胞减少。结论: 含hGax的重组腺病毒载体构建成功,并在细胞中过表达。hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖和迁移,并使细胞停滞于G₀/G₁期。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

转染Lgr5基因对结肠癌细胞株体外生物学特性影响的研究

目的 构建pIRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体,获得SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株,并探讨转染Lgr5基因对结肠癌细胞株生物学特性的影响.方法 运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从结肠癌组织中获得Lgr5全长基因,经双酶切(XhoI和BamHI)连接入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用脂质体法转染SW480细胞,经流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达;CCK-8法和悬滴实验分析Lgr5对结肠癌细胞增殖率和成球能力的影响,划痕实验分析Lgr5对结肠癌细胞迁移能力的影响.结果 成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP/hLgr5,并获得SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株;转染Lgr5基因的结肠癌细胞体外增殖速度加快,形成的细胞球大而紧密但迁移能力下降.结论 Lgr5基因转染促进结肠癌细胞株体外的生长,为进一步研究人Lgr5分子的生物学特性及其在结肠癌中的作用机制奠定了基础.     

人黑色素浓集激素受体2基因shRNA真核表达载体体外转染

目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率。结果与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上。     

人巨细胞病毒感染对宿主细胞周期素依赖性蛋白激酶2的影响

目的 观察HCMV感染细胞周期素依赖性蛋白激酶2（Cdk2）的亚细胞定位，研究HCMV感染对Cdk2蛋白水平及对细胞周期蛋白E（CyclinE）／Cdk2激酶活性的影响。方法通过密度抑制使细胞同步化于G0／G1期，用HCMV AD169毒株感染人胚肺成纤维细胞（HEL），用免疫细胞化学技术分别测定HCMV感染前及感染后24 h Cdk2亚细胞定位；Western Blot法测定HCMV Cdk2蛋白丰度；用免疫沉淀，激酶活性分析法检测HCMV感染细胞内Cdk2的活性。结果 接触抑制阻止在Go期细胞Cdk2游离在细胞质，HCMV感染24h内导致Cdk2从细胞质移位到细胞核。同时HCMV感染可引起cvclinE／Cdk2激酶的强烈激活，但HCMV感染并不诱导Cdk2蛋白丰度增加。结论HCMV感染G0／G1细胞，在24h内导致Cdk2从细胞质移位到细胞核，使之与细胞核内的调节亚单位CyclinE结合，激活CyclinE／Cdk2激酶，使细胞周期越过G1，S限制点，进展至晚G1期。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

hsMAD2基因及Nocodazole对人肝癌细胞生长和细胞周期的影响

目的观察hsMAD2过表达以及联合Nocodazole处理对HepG2细胞的生长和细胞周期的影响。方法将人全长hsMAD2基因经脂质体包裹转染肝细胞肝癌HepG2细胞,经G418筛选期获得转基因癌细胞克隆,采用免疫细胞化学法、Western blot方法检测hsMAD2的表达情况。观察细胞形态、测量生长曲线和分裂指数曲线,观察hsMAD2基因对HepG2细胞生长和细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测HepG2细胞周期的变化。然后观察在纺锤体阻滞剂50nmol/L Nocodazole作用下,hsMAD2对HepG2细胞的影响。结果稳定表达外源性hsMAD2蛋白的HepG2细胞生长速度和细胞增殖能力并无变化;流式细胞仪检测结果显示HepG2-hsMAD2细胞周期G2、S期比例增加,而G1期细胞比例下降,但差异无显著性。经过nocodazole处理后,HepG2-hsMAD2细胞生长速度下降,差异具有显著性,细胞周期出现G2期阻滞。相反。HepG2在受到Nocodazole处理后无明显变化。结论单纯过表达外源性hsMAD2对细胞无影响。由于hsMAD2蛋白发挥了细胞周期关卡作用,使受到Nocodazole破坏作用的细胞出现细胞周期的阻滞。     

HMGB2对肺腺癌细胞周期和增殖的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白B2(HMGB2)对肺腺癌细胞周期和增殖的影响。方法:从Cancer RNA-Seq Nexus (CRN)数据库分析肺腺癌组织HMGB2表达情况;从OncoLnc数据库分析HMGB2与肺腺癌患者预后的相关性;从肿瘤单细胞数据库(CancerSEA)分析HMGB2与肺腺癌细胞14种功能状态的相关性;利用siRNA技术下调人肺腺癌A549细胞中HMGB2表达,通过real-time PCR和Western blot验证沉默效果,CCK8和EdU实验检测细胞的增殖。结果:HMGB2在肺腺癌中高表达;HMGB2高表达组肺腺癌患者的总生存期明显低于HMGB2低表达患者(log-rank检验P=0.017 3);HMGB2表达与肺腺癌细胞周期和增殖呈正相关;敲减HMGB2表达后A549细胞的活力和增殖能力显著降低(P<0.05)。结论:HMGB2的表达与肺腺癌细胞周期和增殖显著正相关,可以作为潜在的评估肺腺癌患者预后的标志物和治疗靶标。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人软骨细胞细胞周期的影响

目的:观察转染增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因后原代培养的人鼻中隔软骨细胞的细胞周期的变化,建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1 质粒,通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞,应用激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率和细胞周期的变化。结果:增强型绿色荧光蛋白基因在转染24 h后得到了明显表达,48 h后流式细胞仪检测其表达率为35.37％,细胞周期没有明显的改变,且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人鼻中隔软骨细胞仍能在体外存活,对软骨细胞的生长没有明显的影响,pEGFP-N1是转染原代培养的人鼻中隔软骨细胞较为理想的瞬时表达载体,也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

茶多酚对HL-60细胞株体外增殖及细胞周期的影响

目的 探讨茶多酚对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT比色法)观察茶多酚对体外培养的HL-60细胞增殖活性的影响.采用HE染色、荧光染色观察用茶多酚后细胞形态变化.用流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡率及细胞周期.结果 (1)MTT比色法检测显示茶多酚能抑制HL-60细胞增殖,在一定范围内呈剂量和时间依赖性(P＜0.05).当茶多酚浓度达到400和800 mg/L时,48 h抑制率分别为(58.90±1.19)%和(72.57±0.70)%.(2)流式细胞仪分析,茶多酚处理组出现一特征性的亚二倍体凋亡峰.其凋亡率呈时间、剂量依赖性.(3)流式细胞术发现茶多酚可使HL-60细胞阻滞于S期,其阻滞细胞的数量与药物浓度呈正相剂量关系,以作用24 h对细胞周期的阻滞作用最强.结论 茶多酚能有效抑制HL-60细胞增殖,在一定范围内具有时间和剂量依赖性.茶多酚可体外诱导HL-60细胞凋亡,并使细胞周期阻滞于S期.     

Norrin基因对人视网膜微血管内皮细胞增殖和周期的影响

目的：体外培养并鉴定人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs），并探讨Norrin基因高表达对HRCECs增殖和周期的影响。方法： 体外分离、培养并鉴定人视网膜微血管内皮细胞，抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定细胞。利用脂质体lipofectamine 2000将AP-3myc-hNorrin/pRK5质粒转染HRCECs，RT-PCR、免疫组化和Western blotting方法检测Norrin/myc的表达确定转染效率。采用MTT法测定转染后细胞的增殖能力，流式细胞术分析其细胞周期变化。结果： 所培养的细胞第Ⅷ因子相关抗原免疫组化为强阳性。AP-3myc-hNorrin/pRK5质粒转染后 24 h，RT-PCR显示实验组Norrin表达水平明显高于阴性对照组(P<0.01)。转染后48h免疫组化及Western blotting均显示实验组细胞Myc表达强于阴性对照组。MTT法显示细胞增殖高于对照组，细胞周期检测示实验组G2期细胞高于阴性对照组，P<0.01。结论：脂质体能成功转染AP-3myc-hNorrin/pRK5进入HRCECs。Norrin高表达能促进HRCECs的增殖，并促进细胞DNA合成，提示Norrin在视网膜血管生成过程中可能具有重要作用。     

野生型PTEN基因对卵巢癌细胞株的影响

目的： 观察转入野生型PTEN基因的卵巢癌细胞生物学行为变化，探索该基因对卵巢癌细胞周期的影响和抑制肿瘤侵袭的机制。 方法： 将野生型PTEN基因的pcDNA3.1Hygro(-)真核质粒载体转染SKOV3细胞系，潮霉素筛选稳定表达细胞株并扩增培养；采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化；用MTT法检测细胞抑制率。分别用RT-PCR检测转染前后PTEN mRNA表达水平变化；采用重组基底膜侵袭模型，观察转染前后细胞侵袭力的变化。 结果： 成功转染SKOV3并稳定表达PTEN，转染PTEN可以明显改变SKOV3细胞周期，使其阻滞于S期；明显抑制肿瘤细胞的侵袭力。 结论： 提示转染外源野生型PTEN基因可使SKOV3细胞周期阻滞于S期，并且通过抑制肿瘤细胞侵袭与生长，而具有明显的抑癌作用。     

notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响

目的：探讨notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响。方法: 体外构建notch1-shRNA和pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体,采用RT-PCR和Western blotting方法行notch1沉默和高表达notch1胞内段的效果检测,MTT法和PI单染流式细胞术分析notch1对细胞增殖和细胞周期的影响。结果：notch1-shRNA慢病毒表达载体能有效下调notch1表达,而pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体能有效增加NICD的表达。notch1基因表达下调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),并引起细胞G1期阻滞(P<0.01), S期减少(P<0.01);在NICD表达增加的细胞其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起细胞G1期减少(P<0.05),S期增加(P<0.01)。结论: notch1基因与人胶质瘤U251细胞的增殖能力和周期密切相关,有望成为治疗胶质瘤的靶点。     

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的:构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法:构建带绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人era真核表达载体,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果:无论EGFP融合于人Era的C端或N端,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处,细胞形态无明显变化,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论:人era可能参与细胞周期调控,为阐明人era的功能提供了资料。     

化瘀消瘤方含药血清对体外培养的人肺癌细胞周期的影响

目的：探讨化瘀消瘤方含药血清对肺癌细胞周期的作用。方法：制备高、中、低剂量含药血清、西药血清和对照血清，作用于人肺癌细胞。MTT法观察血清对细胞增殖的作用，流式细胞仪进行细胞周期时相分析。结果：高剂量含药血清组与对照血清组之间的吸光度差异有统计学意义(P<0.01)，中剂量血清组、高剂量血清组的S期细胞所占比例与对照血清组之间的差异有统计学意义(中剂量血清组P<0.05，高剂量血清组P<0.01)。结论:本实验提示化瘀消瘤方含药血清可能是通过干扰细胞DNA合成而抑制肺癌细胞的增殖，为该药的临床应用提供了科学的实验依据。     

喜树碱对小鼠T淋巴细胞活化、增殖以及细胞周期的影响

目的： 研究喜树碱（CPT）对刀豆蛋白A(ConA)介导的小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖及细胞周期的影响。方法：以ConA刺激小鼠T淋巴细胞，建立小鼠T淋巴细胞活化、增殖的模型，以不同浓度的CPT作用于该模型，流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69分子的表达；以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）染色流式细胞术分析CPT 在Con A刺激下小鼠淋巴细胞的增殖相关指数（PI）；以碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况。 结果： ConA作用6 h后流式细胞术分析显示CD69的表达率为（58.88±0.55）%，不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）CD69的表达率分别为（55.48±0.98）%、（54.67±1.05）%、（50.40±0.82）%、（42.47±1.32）%，均可明显抑制CD69的表达(P<0.01)；ConA刺激48 h后流式细胞术分析显示，不同浓度的 CPT 组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）的增殖指数（PI）明显低于对照组(P<0.05)；细胞周期分析显示刺激48 h后不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）均出现明显的凋亡峰（apoptosis peak，AP），sub-G1期、G₀/G₁期细胞的比率明显高于ConA刺激组(P<0.01)。结论：CPT可明显抑制ConA刺激的T淋巴细胞的活化、增殖，同时使淋巴细胞阻滞于G₀/G₁期。