地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究

就地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行了研究,以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标,对产酶条件进行优化,并研究了该酶的基本酶学特性;确定了培养基的最佳碳源为玉米粉.最佳氮源为黄豆饼粉,C/N在1:2～1:1范围时去酰胺度最高;最适摇瓶发酵条件为:种龄18h,接种量2%,装液量30mL/100mL,摇床转速140r/min,pH 7.0,35℃,发酵50h;碱性蛋白酶最适作用pH为10.0,最适反应温度为50℃,60℃保温2h后仅存5.9%的活力,在pH8～11之间有较高的pH稳定性.     

紫外诱变高去酰胺活性碱性蛋白酶生产菌的研究

对3株地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶的去酰胺能力和肽键水解能力进行了比较,确定了1株去酰胺能力强而肽键水解能力弱的菌株,经过紫外诱变,筛选获得1株产碱性蛋白酶的去酰胺能力有显著提高的菌株SDZ-61,去酰胺对达到了27.96%,比诱变前提高了56.6%,而肽键水解度基本没变.     

牛骨蛋白酶解工艺条件的优化

以水解度和氮收率为指标,研究酶制剂种类、底物质量浓度、加酶量、酶解时间、pH 值及酶解温度对牛骨酶解工艺的影响,并采用二次正交旋转组合设计进行工艺优化,得到最佳优化工艺条件：确定木瓜蛋白酶作为试验用酶、底物质量浓度1g/100mL、加酶量6000U/g、酶解温度60℃、pH6.5、酶解时间3h。在该条件下制备的酶解产物水解度可达26.27%。考虑到酶解后固形物的产率,选取底物质量浓度为5g/100mL 进行工艺试验,根据回归方程可得水解度的理论值为18.33%。经反复实验证实,在5g/100mL 的底物质量浓度条件下,牛骨酶解产物水解度可达16.5%～20%,氮收率可达84.5%～92%。     

利用冷榨花生饼制备花生多肽饮料

以冷榨花生饼为原料,采用碱法和酶水解法制备花生蛋白,以蛋白质提取率为指标,确定蛋白提取条件,并利用所提取蛋白或蛋白水解物经乳酸菌发酵制备花生多肽饮料。结果表明NaOH溶液提取花生蛋白的最佳条件为：pH9.0、温度55℃、料液比1:8(g/mL)、浸提2h,蛋白提取率80.68%;胰蛋白酶水解蛋白的最佳条件为：酶与底物比1:50(m/m)、底物质量浓度5g/100mL、pH9.0、水解温度50℃,蛋白提取率96.26%。以花生水解蛋白和脱盐乳清粉为原料,采用直投式乳酸菌为发酵剂,发酵条件为：花生水解蛋白质量浓度2g/100mL、乳清粉加入量1g/100mL、发酵剂与发酵液比1:25(g/kg)、42℃发酵5h、4℃后熟15h、蔗糖质量分数9%时的口感最佳。     

高效产脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1产酶条件优化

从油菜地土壤中分离到一株高效产脂肪酶菌株C1,经鉴定为Burkholderia cepacia。为了进一步提高C1 脂肪酶的产量,对其产酶的发酵条件进行优化。首先采用单因子试验筛选出最佳碳源为麸皮,最佳氮源为蛋白胨。通过Plackett-Burman 设计对发酵产酶的11 个相关因子进行试验,筛选出3 个主效因子,即蛋白胨质量浓度、橄榄油质量浓度及装液量。利用Box-Behnken 试验设计和响应曲面法分析确定主效因子的最优水平,得出产脂肪酶菌株C1 的最优产酶条件：1.50g/100mL 麸皮、1.05g/100mL 蛋白胨、1.63g/100mL 橄榄油、0.2g/100mL K2HPO4、0.05g/100mL MgSO4、初始pH 值为7.0、装液量为30mL。在优化条件下30℃,180r/min 培养72h,脂肪酶活力达到89.65U/mL,比未优化前的28.50U/mL 提高了2.15 倍。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

木质纤维素酶解糖化发酵研究

考察添加剂对绿色木霉产纤维素酶的影响.结果表明,初始培养基中添加油酸、十二烷基酸钠(SDS)、麦芽糖、羧甲基纤维素(CMC)、水杨素和水解淀粉等对绿色木霉产纤维素酶有促进作用,其中添加2%油酸和1%SDS均可使酶活提高1倍以上.在木质纤维素酶的水解过程中,在酶液中添加Mg2+、K+、Co2+、Tween 80、聚乙二醇(PEG)等均对酶有激活作用;当底物浓度为30%,酶量1.0 FPA/mL,PEG6000浓度0.14%,Co2+浓度为0.06%,搅拌速度120 r/min条件下,能得到较高的糖浓度(85 g/L).乙醇发酵过程,发现木糖、葡萄糖单独发酵得酒精度分别为0.7g/100 mL和4.3/100 mL;木糖-葡萄糖分步发酵的酒精浓度可达5.1g/100 mL,而木糖-葡萄糖同步发酵得酒精浓度仅为4.4g/100mL.     

芝麻蛋白制备金属螯合肽的酶解工艺研究

分别采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶Alcalase对芝麻蛋白进行水解,结果表明胰蛋白酶为制备金属螯合肽的最佳酶。通过优化胰蛋白酶酶解工艺条件发现最佳条件为:底物质量浓度5%(g/100mL),酶添加浓度20u/g(底物),水解时间5h,得到的酶解产物金属螯合率最强,与Fe2+的螯合率为90.9%,与Zn2+的螯合率为93.5%。通过考察水解度对酶解产物金属螯合率及抗氧化能力的影响,结果显示水解度在18.9%到22.4%之间的酶解产物金属螯合率强,且水解度在一定范围内金属螯合率和抗氧化能力均与水解度呈正相关性。     

一株产木聚糖酶放线菌的液体发酵条件优化及水解特性研究

以木聚糖为唯一碳源制作选择培养基,利用透明圈法筛选高产木聚糖酶菌株,对其中一株产酶较高的菌株L10608进行液体发酵条件优化并对所产木聚糖酶的水解特性进行研究。结果表明:菌株L10608最佳产酶条件为以质量浓度25g/L、80目的水不溶性玉米芯木聚糖为碳源,10g/L大豆蛋白胨和5g/L酵母浸膏为复合氮源,初始pH6.0、培养温度40℃、转速200r/min、表面活性剂吐温-80质量浓度4g/L,最佳产酶条件下木聚糖酶活力达1074.8U/mL。以桦木木聚糖、榉木木聚糖和燕麦木聚糖为底物研究菌株L10608所产木聚糖酶的水解特性,结果表明该木聚糖酶为内切型木聚糖酶,水解主要产物为木二糖和木三糖。表明菌株L10608有望作为功能性低聚木糖的生产菌株。     

纤维素酶水解稻草纸浆制取乙醇的研究

对Candida shehatae发酵稻草纸浆水解液生产乙醇的工艺进行了初步研究.分别对影响酶水解和发酵阶段的各因素进行了优化.结果表明,利用正交试验确定的最佳酶水解条件为:酶用量150U/g料,底物浓度2%,反应温度55℃,pH4.8,反应时间8 h,酶解得率可达到73.20%.初始葡萄糖浓度为60g/L,装液量100mL/250mL,无机氮源为(NH4)2SO4,转速为100r/min,温度为28℃,pH值为5.5,发酵时间为48h,在此条件下乙醇得率可达49.72%,能达到理论得率的97%,转化率最高为0.36g/g(乙醇/稻草纸浆).     

氯化锂诱变蛹虫草菌株液体发酵富集微量元素锌

为更好地开发蛹虫草资源,以蛹虫草为富锌载体,进行发酵富锌培养条件优化,选择最佳质量分数的Li Cl诱变蛹虫草,通过火焰原子吸收法检测诱变前后菌丝体中锌元素的含量。结果表明:蛹虫草富锌的最优碳源为蔗糖,质量分数为3%,最优氮源为蛋白胨,质量分数为3%,最佳培养时间为6 d,最佳接种量为5%,最佳装液量为100 m L/250 m L,培养基中添加的最佳Zn SO4质量浓度为100μg/m L,此时,富锌率为18.54%。Li Cl的最佳诱变条件为:Li Cl质量分数0.15%。选育出富锌较高菌株5株,最高富锌率达24.68%,比出发菌株提高了近42%,具有广阔的应用前景。     

弹性蛋白酶产生菌的分离鉴定和发酵条件研究

从污水河的土壤中采集样品,分离得到一株产胞外弹性蛋白酶活性较高且稳定的细菌。经初步鉴定属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B1),其酶活力为74.25U/ml。对其进行物理诱变,诱变后的菌株(B9)产酶活性有较大的提高。B9酶活力为120.00U/ml,较原菌株提高了1.62倍。同时研究了其产酶最适条件,产酶最适碳源为蔗糖,最适氮源为干酪素,并对碳源、氮源和生长因子进行了正交试验,研究发现氮源对产酶的影响最大。当蔗糖的用量为4%、干酪素为3%、玉米提取液为0.1%时具有较高的产酶水平。最适发酵初始pH为8.0、300ml最适摇瓶装量为40ml、最适接种量为3%。经发酵条件的优化后,B9酶活达到311.54U/ml、提高了2.59倍;较以往国内报道的酶活要高。     

液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽培养基条件优化

以菜籽粕为原料,通过枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE 抑制肽。先以肽得率、ACE 抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的培养基条件,再以响应面分析法,优化枯草芽孢杆菌液态发酵培养基中的3 种成分,确定枯草芽孢杆菌发酵生产菜籽肽的最佳培养基工艺条件为：磷酸二氢钾0.45g/100mL、葡萄糖0.8g/100mL、料液比1:23、初始pH7.0。优化后的ACE 抑制率可达69.79%。     

蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化

蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase,PG)对植物蛋白具有高效的脱酰胺作用,可提高蛋白的溶解度,进而改善其起泡性、凝胶性等功能性质,在植物性食品中有巨大的应用前景。但由于原始菌株解脘金黄杆菌PG产量低,需异源重组表达以提高产量。将PG基因重组到质粒pHT43,采用强组成型启动子P 43替换pHT43的诱导型启动子P grac,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得表达菌株pHT43:pro-mPG(P 43)/BL21(DE3)。将发酵16 h的重组菌超声破碎,菌体上清液中含有带前导肽的PG,经镍柱纯化、脱盐及浓缩后,用0.3 mg/mL的胰蛋白酶酶切,得到成熟的PG。SDS-PAGE显示PG消化前后分子量分别约为38 kDa和20 kDa,Western-blot结果表明两者均能与his-tag抗体结合显色。成熟PG的酶活力为0.250 U/mL,酶反应的最适条件为45℃、pH 6.5。发酵条件优化后的最佳产酶培养基配方为:4 g/L谷氨酰胺,4 g/L蔗糖,1 g/L酵母提取物,8 g/L酵母浸粉,2 g/L胰蛋白胨,10 g/L NaCl,3 g/L CaCl 2。37℃、pH 6.5条件下发酵16 h,最终酶活力提高至0.761 U/mL。     

氮离子注入蛹虫草选育高效富硒菌株的研究

为了更好地开发蛹虫草资源,对蛹虫草菌株富集微量元素硒的培养条件进行了优化,选择最佳参数的低能离子束注入蛹虫草,通过石墨炉原子吸收光谱法检测注入前后菌丝体中硒元素的含量。结果表明：蛹虫草发酵富硒的最优培养条件为蛋白胨质量浓度3 g/100 mL、葡萄糖质量浓度3 g/100 mL、亚硒酸钠质量浓度为8 μg/mL、pH值为7,此时,富硒率为21.58%。离子束最佳注入参数为：注入离子为N+,注入能量10 keV,注入剂量1.82×1015 ions/cm2,选育出富集微量元素硒较高的10 株菌株,最高富硒率为30.97%,比出发菌株提高了近42%。     

响应面法优化产β-内酰胺酶菌Bacillus cereus B03的发酵条件

为快速高效地提高菌株Bacillus cereus B03的产酶能力,采用响应面法对Bacillus cereus B03产β-内酰胺酶的发酵培养基进行优化。首先通过单因素实验研究了不同碳源及浓度、不同氮源及浓度、不同金属离子及浓度、氯化钠、磷酸氢二钾以及温度、pH、接种量、装液量对菌株产酶活力的影响,然后设计Plackett-Burman试验筛选出影响产酶的3个显著性因素:温度、pH、接种量。在此基础上,最后设计Box-Behnken中心组合试验确定最优产酶发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L,K₂HPO₄·3H₂O 4 g/L,最佳产酶发酵条件为发酵温度37 ℃,pH为7.3,接种量3%,装液量50 mL/250 mL。在此优化条件下,该菌株产β-内酰胺酶的酶活力为113278.7 U/mL,为优化之前酶活(88792.7 U/mL)的1.28倍。本研究为进一步工业化开发利用性状稳定且高产β-内酰胺酶的菌株提供借鉴。     

丁醇高产菌株诱变育种及发酵条件优化研究

利用低温等离子体和亚硝基胍(NTG)对兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌(Bacillus sp.)C2菌株进行复合诱变,分离筛选得到3株丁醇和总溶剂产量均有明显提高的突变菌株,其发酵7%玉米醪液后丁醇和总溶剂产量分别达到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L,比出发菌株分别提高21.6%～24.5%和15.4%～19.1%.对编号为414的突变菌株发酵条件进行优化,在100mL三角瓶发酵体系中,该菌株的最适发酵条件为装液量100mL,种龄24h,接种量10%,pH 7(自然),37℃静置发酵72h,在此条件下,414菌株发酵7%玉米醪液产丁醇和总溶剂量分别达到12.58g/L～13.77g/L和21.25g/L～22.27g/L.     

海洋源纤溶酶高产菌株的诱变育种及液体培养基优化

为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H-A-03为出发菌株,经过60Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得了组分更简单、用量更少、更利于菌株产酶的培养基：可溶性淀粉41.6 g/L、黄豆粕粉26.2 g/L、CaCl2 1.0 g/L,KH2PO4 2.0 g/L。在此基础上,3 L摇瓶放大试验结果显示,菌株F8-C的产酶量达到（3 231±21） U/mL,较出发菌株H-A-3提高44.8%。结果表明利用60Co辐射诱变育种,并采用统计学方法优化培养基,对于提高枯草芽孢杆菌纤溶酶的产酶量是一种有效策略。该研究结果也将为下一步发酵罐扩大试验奠定基础。