微小RNA-21/信号传导及转录激活因子3信号通路调控与肿瘤的关系研究进展

微小RNA(miRNA)是机体内一种重要的基因调控因子,参与多种肿瘤的发生发展,信号传导及转录激活因子(STAT)是众多细胞因子的信号传导蛋白,miRNA/STAT信号通路调控二者之间的相互作用,与机体的生长发育、细胞分化、代谢以及肿瘤的发生关系密切,本文就近年来miRNA-21/STAT3信号传导通路调节及与肿瘤发生的相互关系进行综述。     

小鼠STAT4，STAT6基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定小鼠信号转导子和转录激活因子4(STAT4),信号转导子和转录激活因子6(STAT6)具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒.方法:根据STAT4和STAT6基因mRNA序列,在体外分别合成有小发夹结构的2条STAT4特异性寡核苷酸序列,2条STAT6特异性寡核苷酸序列,退火后与线性化pGenesil-3质粒连接,转化感受态细胞DH5α,扩增,纯化得到所需质粒.同时设计构建分别针对小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的干扰质粒作为阳性对照,不具有基因同源性的非特异性基因的质粒作为阴性对照序列.通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和基因测鉴定纯化质粒分子量及插入片段的序列.结果:经限制性酶切和测序鉴定分析证实基因插入正确,与设计的序列完全相符.结论:成功构建了针对小鼠STAT4,STAT6基因的发夹结构小干扰RNA表达载体.为今后利用基因沉默技术从转录后水平抑制STAT4,STAT6的研究奠定基础.     

信号转录激活子3基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人信号转录激活子3（STAT3）基因shRNA慢病毒载体。方法：从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条有效靶序列,合成3对针对靶序列的siRNA oligo,通过筛选获得最佳靶序列后合成相应的shRNA模板,将合成好的两条互补的DNA单链退火形成双链DNA,经与BamH Ⅰ和Xho I酶切的pRNAT-U6.2/Lenti载体连接后产生shRNA慢病毒载体,酶切和测序鉴定。结果：酶切和测序鉴证实合成STAT3shRNA慢病毒载体寡核甘酸链插入正确。结论：成功构建人STAT3基因shRNA慢病毒载体。     

人上皮细胞黏附分子shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)基因为靶基因,构建shRNA重组表达载体。方法根据Gen Bank中Ep CAM序列(BC014785.1)的mRNA设计4组shRNA序列,插入p SGU6/GFP/Neo载体,构建重组载体,转化至Top10感受态细胞,经卡那霉素筛选并挑取阳性克隆,进行PCR鉴定及DNA测序分析。结果 PCR鉴定及DNA测序结果显示重组载体Ep CAM-p SGU6/GFP/Neo-shRNA构建成功。结论成功构建了干扰人Ep CAM基因的重组表达载体,为研究Ep CAM分子的生物学功能打下基础。     

HnPNPB1基因短发夹环RNA载体的构建与鉴定

目的 利用RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术,构建HnRNPB1表达载体,并进行鉴定。方法 采用H1启动子,分别把被7bP序列间隔的21bp长短的HnRNPB1靶序列的反向重复序列,置于PsiRNA-hH1neoG2质粒中,分别构建HnRNPB1短发夹环RNA（shRNA）,产生重组质粒PSiRNA—hHl neoG2 HnRNPB1。结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,并作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列。结论 针对HnRNPB1基因的特异性ShRNA真核表达载体PSiR—NA—hH1 neoG2 HnRNPB1的成功构建,为进一步研究其基因功能打下基础。     

乳腺癌组织中信号传导和转录激活因子1的表达及其与预后的关系

目的:探讨乳腺良、恶性肿瘤组织中信号传导和转录激活因子1(STAT1)的表达,阐明其表达与乳腺癌预后的关系。方法:采用免疫组织化学法检测87例乳腺癌患者的和37例良性乳腺肿瘤患者肿瘤组织中STAT1的表达情况,分析其表达与患者不同临床参数和预后的关系。采用Kaplan-Merier法进行生存分析,绘制生存曲线,采用Log-rank检验比较生存曲线的差异。采用COX比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。结果:乳腺癌组织中STAT1强阳性率小于乳腺良性肿瘤组织(P<0.01)。孕激素受体(PR)阳性乳腺癌患者的STAT1强阳性表达率高于PR阴性患者(P<0.05)。STAT1强阳性表达患者的总生存期(OS)长于弱阳性表达者(P=0.044);而STAT1强阳性表达患者的无病生存期(DFS)长于弱阳性表达者,但组间比较差异无统计学意义(P=0.071)。单因素分析,是否行术后内分泌治疗、STAT1表达状态、激素受体状态、Her-2表达状态是影响患者OS的因素;TNM分期、是否行术后内分泌治疗、激素受体状态、Her-2表达状态是影响患者DFS的因素。多因素分析,是否行术后内分泌治疗和PR表达状态为影响患者OS的独立预后因素;TNM分期、是否行术后内分泌治疗和PR表达状态、Her-2表达状态为影响患者DFS的独立预后因素。结论:STAT1在PR阳性的乳腺癌组织中表达率高,STAT1的表达情况对患者的预后具有积极的影响。     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞(hDCs)信号传导通路抑制因子1(SOCS1)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因(NM-0037),筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(含U6启动子和EGFP)连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

人AQP1-shRN A 表达质粒载体的构建与筛选

目的：构建针对人水通道蛋白1（AQP1）基因的shRNA表达质粒载体,并验证其干扰效果,为进一步探讨AQP1基因对人乳腺癌细胞的作用及机制建立基础。方法设计合成4对针对人AQP1基因不同位点的shRNA片段,通过DNA重组技术将其插入载体GV115中,构建AQP1‐shRNA重组质粒,转染人乳腺癌MCF‐7细胞,并通过实时荧光定量 PCR（RT‐PCR）和Western blot法检测干扰效率。结果 RT‐PCR法证实AQP1在乳腺癌 MCF‐7细胞中有表达。测序验证表明4对靶向AQP1‐shRNA表达载体均构建成功。4组干扰载体能够从基因和蛋白表达水平不同程度抑制 AQP1表达,其中以AQP1‐shRNA 4对AQP1的干扰效率最强。结论成功有效地构建了针对人AQP1基因的shRNA重组质粒,能够有效抑制人乳腺癌细胞MCF‐7中A Q P1的表达。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549...     

人高迁移率族蛋白组A1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定人高迁移率族蛋白组A1(HMGA1)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法:针对已经筛选确定的HMGA1基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体(含U6启动子和绿色荧光蛋白)连接产生LV-sh HMGA1慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-sh HMGA1慢病毒载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0等3种质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR和测序证实,成功构建LV-shHMGA1的慢病毒载体,病毒滴度达5×107TU/ml。结论:人HMGA1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建为进一步应用RNAi技术研究HMGA1基因的功能打下了基础。     

STAT3-siRNA表达框架的设计与构建

【目的】设计和构建针对STAT3基因的siRNA表达框架，并在结直肠癌细胞中观察其干扰效果。【方法】GeneBank中查询STAT3基因序列，Oligo 6．0软件设计siRNA靶序列，合成并修饰靶序列后PCR扩增siRNA表达框架，通过脂质体介导，直接将扩增产物转染至结直肠癌细胞SW480中，48h后提取细胞总RNA进行RT—PCR检测干扰效果。【结果】RT-PCR结果显示SW480细胞内靶基因STAT3 mRNA水平下降（62．16±12．50）％。【结论】本实验成功设计并构建的siRNA表达框架能干扰人结直肠癌SW480细胞内STAT3基因的表达。     

细胞周期素D1shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 设计针对cyclin D1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰栽体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48 h后用Real time PCK和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cycli D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响.结果 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的 基因片断.转染cyclin D1-shRNA的A549细胞48 h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量.以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效.其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖.结论 成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.