胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞*☆

目的:培养小鼠胰腺导管上皮细胞并使之转分化为胰腺干细胞及胰岛样细胞,为胰岛移植治疗糖尿病提供细胞来源。方法 分离培养昆明小鼠胰腺导管上皮细胞,以添加有KGF、HGF和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养,不同时间取样本于光镜和电镜下观察,检测第1 d和16 d时CK-19、PDX-1免疫化学染色变化并以半定量RT-PCR检测第1d和16d时胰岛素和胰高血糖素基因表达情况,21d时行双硫腙染色试验及葡萄糖刺激的胰岛素释放试验以检验胰岛样细胞的生理功能。 结果 分离第1d,大部分细胞CK-19染色阳性,偶可见PDX-1阳性细胞,16d后,CK-19阳性细胞快速增殖形成细胞团,大部分细胞PDX-1染色阳性; RT-PCR显示培养细胞胰岛素和胰高血糖素表达明显增强,分别增加了5.4倍和6.1倍（P<0.01）;21d时胰岛样细胞团更加成熟,双硫腙着色阳性,且对高糖（15mmol/l）刺激的胰岛素释放较低糖（5.6mmol/l）时增加了1.6倍（P<0.05）。 结论 小鼠胰腺导管上皮细胞在体外培养条件下可增殖,并具有干细胞潜能,可转分化胰岛素分泌细胞。     

胰腺干细胞体外培养扩增的方法

背景：胰腺干细胞在体外培养时极易分化,很难获得足够数量的胰腺干细胞。 目的：探讨一种简便易行的胰腺干细胞体外扩增培养方法。 方法：分离新生昆明小鼠胰腺,原代培养三四天,成纤维细胞中出现呈集落生长的胰腺干细胞后,以0.02%EDTA消减成纤维细胞的数量,降低其比例后继续培养,待细胞铺满培养瓶底的80%时,重复三四次,逐渐提高胰腺干细胞的数量。检测胰腺干细胞特异性标志Nestin。尼克酰胺诱导胰腺干细胞分化;双硫腙染色对胰岛样细胞团进行检测。 结果与结论：消减胰腺成纤维细胞的数量及比例后,胰腺干细胞可持续表现出活跃的分裂增殖能力,胰腺干细胞的数量显著增加;细胞保持球形、单个大核、细胞质折光性强、表达(Nestin)。扩增的胰腺干细胞,以尼克酰胺诱导后分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性。提示,减少共培养中成纤维细胞的比例和数量,有利于胰腺干细胞的增殖,获得较多数量的胰腺干细胞。扩增后的胰腺干细胞仍保持未分化状态,在适当的体外诱导条件下能分化为胰岛样结构,具有一定的分化潜能。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景：体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用。关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道。 目的：进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。 方法：采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养;传2代后,用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10％胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化。倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素。 结果与结论：第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

不同细胞因子组合体外诱导人脐血干细胞向胰岛样细胞分化

背景：由干细胞分化而来的胰岛样细胞存在数量少、胰岛素分泌量少以及能否达到临床移植要求等问题。 目的：观察不同细胞因子组合对人脐血干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-05/09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。 材料：脐血来源于足月分娩的健康产妇,由沈阳市德济医院提供。 方法：密度梯度离心法体外分离人脐血单个核细胞,诱导1组首先以低糖DMEM培养液进行培养,添加20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子,培养成巢蛋白阳性细胞后改为高糖DMEM培养液,添加2% B27和10 mmol/L尼可酰胺。诱导2组直接以高糖DMEM培养液进行培养,添加20 mmol/L尼可酰胺、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L肝细胞生长因子、2% B27及0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇。对照组只添加与诱导组相同的培养液,不加入任何细胞因子。 主要观察指标：诱导分化后对贴壁细胞进行形态学观察、胰岛素抗体的细胞免疫荧光染色及双硫腙染色鉴定。 结果：体外培养的人脐血干细胞通过细胞因子组合诱导后,可见散在的胰岛样细胞或成群的胰岛样细胞群,呈Insulin阳性反应。诱导1组细胞散在或成群分布,诱导2组则多为散在分布的胰岛样细胞,且细胞相对较小,几乎没有胰岛细胞团。双硫腙染色后诱导1组有少部分较大的胰岛样细胞呈阴性,诱导2组细胞均呈棕红色阳性表达,未诱导的对照组细胞呈阴性。 结论：人脐血干细胞通过不同细胞因子组合诱导后具有向胰岛样细胞分化的潜能,但诱导1组中部分细胞可能是非胰岛素细胞,而诱导2组胰岛样细胞均一性较差,可能与胰岛细胞种类较多、大小不一有关。     

新生昆明小鼠胰腺巢蛋白阳性细胞的自然分化

背景：胰腺干细胞在常规培养条件下易于分化,难以获得足够数量的种子细胞。 目的：探讨体外培养条件下小鼠胰腺内、外分泌部的巢蛋白阳性细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-08/2007-08在广西医科大学基础医学院中心实验室完成。 材料：SPF级新生昆明系小鼠25只,由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：以Ⅳ型胶原酶消化小鼠胰腺组织,采用Percoll不连续密度梯度法分离单个细胞混悬液,分别从第1界面(磷酸盐缓冲液/1.068 g/L Percoll液)、第2界面(1.068 g/L Percoll液/1.096 g/L Percoll液)、第3界面(1.096 g/L Percoll液/ 1.118 g/L PercolI液)收集细胞,添加角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的低糖DMEM培养基进行体外连续培养。 主要观察指标：双硫腙染色判断各界面细胞的来源,免疫组织化学检测各界面细胞巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因蛋白1、角蛋白19的表达。 结果：从第1,2界面收集到的细胞80%~90%双硫腙染色后胞质呈铁红色,表明主要来源于胰腺的内分泌部;从第3界面收集到的细胞双硫腙染色后胞质不染色,表明来源于胰腺的外分泌部。从胰腺的内、外分泌部均可分离出大、圆、单个核的细胞,巢蛋白染色呈阳性表达。随着体外培养时间的延长,来源于胰腺内分泌部的巢蛋白阳性细胞形态保持不变,呈集落样生长,表达胰十二指肠同源盒基因蛋白1,有向胰腺内分泌部β-细胞分化的趋势;来源于胰腺外分泌部的巢蛋白阳性细胞呈铺路石样形态,表达细胞角蛋白19,出现向导管上皮细胞分化的趋势。 结论：新生昆明小鼠胰腺的内分泌部和外分泌部均存在巢蛋白阳性的细胞,前者具有分化为β-细胞的能力,后者具有分化为导管上皮细胞的能力。     

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

背景：随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立，对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。 目的：研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。 方法：自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株，运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团，加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养。 结果与结论：终末分化细胞光镜下呈团状聚集，RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征，是未来治疗1型糖尿病的可用材料。     

脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病★

背景：脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可以向胰岛样细胞诱导分化。 目的：验证脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞诱导分化的可能性，并观察移植后对糖尿病大鼠血糖的影响。 方法：分离、诱导、传代脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞，再与大鼠胰腺细胞共培养，诱导成胰岛细胞团样组织。将大鼠分为3组，正常对照组不进行移植及造模；模型组仅制备糖尿病大鼠模型；实验组造模后将胰岛样细胞移植入糖尿病大鼠肾脏包膜。 结果与结论：脐带Wharton’s Jelly细胞培养中有细胞从组织块中爬出，第7天形态发生变化，贴壁细胞部分变成梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志CD44、CD29、CD105，不表达CD34、CD45、CD14。诱导第7，10天PDX-1及人胰岛素强染色；胰岛素及C-肽浓度较单纯培养组明显升高；PDX-1及人胰岛素mRNA诱导第7、10天较高表达。移植第1周大鼠尾尖血糖链脲佐菌素实验组明显低于模型组(P < 0.01)，但明显高于正常照组(P < 0.01)。8周链脲佐菌素实验组肾脏被膜下发现胞核染棕色染色的Brdu阳性、胞浆棕色染色的胰岛素阳性细胞。结果表明，脐带Wharton’s Jelly中存在脐带源间充质干细胞，与大鼠胰腺细胞共培养可促进间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化，移植入糖尿病大鼠肾脏被膜下，可显著降低糖尿病大鼠血糖。     

不同幼年供体胰段的超微结构观察

背景：随着胰腺移植供体的不足,胰段移植已倍受关注。从解剖学角度认识胰腺各段胰岛和胰岛细胞（A,B细胞）的分布规律,可否得出胰段移植的最佳选择。 目的：观察幼年大鼠胰腺胰尾的微细结构,胎尸胰腺胰尾的微细结构,胰岛B细胞胰高血糖素和胰岛素阳性表达面积及胰岛B细胞免疫阳性染色面积,并予以比较。 设计、时间及地点：对比观察,于2006-01/2007-06在福建医科大学人体解剖组织胚胎学系实验室完成。 材料：出生1周内健康SD大鼠33只,3~10个月龄胎尸胰腺80个,每月龄10个。胰高血糖素抗血清为武汉博士德生物工程公司产品,胰岛素抗血清为北京中山金桥生物技术公司产品,图像处理系统（Videopro32型）由福建医科大学人体解剖实验室提供,Hu-12A型透射电镜为日本电子株式会社产品。 方法：随机选择30只大鼠,取胰尾切片苏木精-伊红染色后光镜观察,显微测微器测量胰岛个数和面积,用胰高血糖素抗血清和胰岛素抗血清进行免疫组织化学染色。另3只大鼠取胰尾组织块铀铅染色,每月龄胎尸各取2例胰尾组织,1例行ABC法胰岛素免疫组化染色,另1例行铀铅染色。 主要观察指标：透射电镜观察并比较胎尸胰及幼年大鼠胰腺B细胞及胰岛形态和数量、结构及其分泌颗粒。 结果：幼年大鼠胰尾组织中胰岛B细胞内分泌颗粒多,内质网、高尔基复合体和线粒体等细胞器发达,胰岛数目分布多,胰岛B细胞的免疫阳性染色面积大。胎尸胰尾有较多而密的胰岛B细胞散在分布,胰岛B细胞分泌颗粒多。 结论：幼年大鼠和胎尸胰腺细胞的分泌活动均旺盛的,消化功能强,适宜作为胰腺胰段胰岛移植供体,且以胰尾为最佳。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展★

学术背景：近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得一些疗效，但仍存在供体匮乏和免疫排斥两大难题。骨髓间充质干细胞在体外可诱导成为胰岛样细胞。 目的：分析总结骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化研究进展。 检索策略：由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1997-08/2007-08的相关文献，检索词“mesenchymal stem cells，insulin secreting cell”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-08/2007-08的相关文献，检索词“骨髓间充质干细胞， 胰岛素分泌细胞”，并限定文章语言种类为中文。共检索到108篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①文章所述内容应与骨髓间充质细胞体外诱导分化为胰岛样细胞密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：①重复性研究。②Meta分析。 文献评价：文献的来源主要是通过对骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中，2篇为综述，其余均为临床或基础实验研究。 资料综合：①由于胰腺和神经系统具有相似的发育控制机制，目前认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号。利用人骨髓间充质干细胞多向分化能力，用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子将其诱导成为nestin阳性细胞，该细胞在添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液中为适宜微环境，将被进一步诱导为胰腺样细胞。②目前针对胰岛素样细胞的鉴定与功能学研究有以下几方面：细胞形态学观察是否有类似胰岛样细胞团的聚集；免疫组织化学检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的表达；用RT-PCR法对诱导后细胞的胰岛素及胰高血糖素基因表达测定；葡萄糖刺激的胰岛素释放试验来研究诱导后胰腺细胞的功能。 结论：随着骨髓间充质干细胞在体外可诱导成胰岛样细胞技术的不断发展，为解决糖尿病细胞治疗所面临的问题提供一个新的方案。经过诱导分化所得到的胰岛样细胞，其胰岛素分泌量远小于正常胰岛细胞，因此目前急需解决在体外高效诱导且符合人生理的胰岛细胞，并将其安全移植入人体等问题。     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景：相对于其他来源的干细胞而言，脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小，但并不等同于无任何免疫排斥反应。 目的：观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化，及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察，于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠36只，随机分为4组：胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只。人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供。 方法：取传至第3代的人脐带间充质干细胞，待细胞融合至70%~80%后，换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基，向胰岛样细胞诱导分化。除正常对照组外，其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。造模后，胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2×106个，间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞，模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL。 主要观察指标：诱导后胰岛样细胞的鉴定，胰岛样细胞的移植效果。 结果：诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长；诱导4 d后细胞向中央聚集，出现胰岛样细胞团，此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多；诱导7 d双硫腙染色呈阳性表达。移植后2周，胰岛样细胞组血糖浓度明显降低，一直维持至第6周；间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降，但4周后血糖浓度上升；模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。免疫组化染色结果显示，移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达，间充质干细胞组仅有表达少量胰岛素，正常对照组胰岛素表达无明显变化。 结论：人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞。与脐带间充质干细胞相比，胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平，且植入后可迅速发挥降糖作用。