重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。     

共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重...     

重组人溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及活性研究

为了构建一种胞内表达人溶菌酶(hLZ)的毕赤酵母工程菌,此研究以人工合成人溶菌酶基因序列,通过酶切位点插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,获得pPICZαA-hLZ。线性化该表达载体,电转化并筛选阳性克隆,甲醇诱导重组蛋白表达后,进行纯化和活性分析。结果表明,通过亲和层析树脂(Ni-IDA)从培养液上清纯化目标蛋白,SDS-PAGE表明目标蛋白为14.7 kDa左右,Western-blot结果表明目标蛋白即为带有6个His标签的重组人溶菌酶,BCA法测定表明纯化后的蛋白浓度为0.121 mg/mL;溶壁微球菌抑菌试验表明该重组人溶菌酶具有部分生物活性。此研究成功地获得了胞内表达且具有部分生物活性的人溶菌酶毕赤酵母工程菌,为重组人溶菌酶作为饲料添加剂开发应用奠定了一定的基础。     

鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

研究从鸡输卵管组织提取细胞总RNA,根据Gene Bank中已发表的鸡溶菌酶基因序列,设计合成特异引物,合成cDNA序列,并以此为模版,PCR扩增鸡溶菌酶基因。用Xho I和Xba I对LYZ基因的PCR产物和真核表达载体pPIC6αA进行双酶切后转化到大肠杆菌(DH5α)中,构建成为真核重组表达载体pPIC6αA-LYZ。该载体经PstXI酶切线性化后,以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主菌X-33中,经Blasticidin抗性筛选,得到鸡溶菌酶基因重组毕赤酵母菌株;甲醇96h(发酵罐诱导100h)诱导表达,经Wetern-blot检测分析,基因重组工程菌株摇瓶诱导表达溶菌酶的表达量约为4mg/l,发酵罐诱导表达的表达量约为10mg/l。     

牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析

为真核表达牛乳溶菌酶,本研究在通过酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因的基础上,将LYZ1基因经克隆构建了高效表达具有生物活性牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZα-A-LYZ1,将其经SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115中,通过Zeocin筛选和PCR鉴定后的阳性重组菌用甲醇诱导60h后,进行SDS-PAGE和western blot鉴定,用溶壁微球菌对其进行活性检测,并对其进行体外抑菌效果检测分析。结果表明:分泌表达的重组目的蛋白约16ku,而且抗血清具有良好的反应原性。活性检测表明,培养液中重组溶菌酶活性达到2842u/mL。体外抑菌试验结果表明,重组牛乳溶菌酶对标准葡萄球菌及大肠杆菌菌株具有较好的抗菌作用,而对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌作用较弱。     

蝉新型抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的Cryptonin基因片段。基因克隆到pPICZα-C质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-Cryptonin。pPICZα-C-Cryptonin通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,Cryptonin蛋白获得分泌表达,其相对分子质量约为2700。表达产物耐热性强,在100℃条件下10min内抗菌活性不变,煮沸30min以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很好的抑菌活性。     

鸡IFN-α基因的多点突变及其在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,在不改变其编码的氨基酸序列的前提下,对鸡IFN-α序列进行PCR介导的定点突变优化,将鸡IFN-α成熟肽序列中136～143位相近的4个Arg密码子和N端的6个稀有密码子突变为毕赤酵母高表达优越密码子,构建了含正确突变和未突变序列的克隆载体pMD-IFNm、pMD-IFN和酵母表达载体pPICZ-IFNm、pPICZ-IFN,电击转化毕赤酵母X-33菌株,经筛选、鉴定表明鸡IFN-α基因已整合到酵母基因组中.通过表达产物的抗病毒活性测定,筛选出突变与未突变高表达酵母转化子各1株.经密码子优化的突变重组酵母菌株PP-IFNm于BMMY培养基中诱导72 h上清中抗病毒活性单位可达410U/mL,其活性比未优化重组酵母株PP-IFN(48.33U/mL)提高了约10倍.     

猪IL-18在酵母中表达及活性检测

以pGEMT/pIL-18为模板,应用PCR法扩增出猪IL-18基因,用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后,插入酵母表达载体pPICZαA中,经酶切、PCR扩增及序列测定,成功构建了酵母重组表达载体pPICZ/pIL-18,电击转化毕赤酵母X-33,应用Zeocin筛选获得高拷贝重组转化菌株,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析重组pIL-18蛋白的表达,并用SephadexG200纯化表达的重组pIL-18蛋白.运用MTT法检测其生物学活性.试验结果表明,重组X-33酵母菌株能够表达分泌性pIL-18,诱导72 h表达量最高,其表达量占总蛋白表达量的38％.而且纯化的重组pIL-18蛋白具有明显促进淋巴细胞增殖的活性.     

环状抗菌肽cyclopsychotride在毕赤酵母X-33中的表达及其活性鉴定

为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。     

猪β干扰素基因的修饰及其蛋白活性的检测

为获得高效表达的重组猪β干扰素,在保留编码蛋白序列的同时,对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA.构建了酵母表达裁体pPICZαC-PIB.pPICZαC-PIB经Sac Ⅰ酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33.对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得1株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约258.3 mg/L,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍.经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达产物为相时分子质量约22 000和24 000的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应.将表达产物进行氨基酸测序,测得2段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致.在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍.用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明.猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性.     

鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达.     

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。     

环状抗菌肽cyclopsychotride在毕赤酵母X -33中的表达及其活性鉴定

为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα -C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα -C- cyclopsychotride,再通过限制性内切酶B...     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

噬菌体裂解酶Lysep3的毕赤酵母重组表达和活性分析

试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZαA。经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33。重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5 L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化。通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析。结果显示,重组菌在5 L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L。抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6～1.7个数量级。此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75%;溶血性分析显示,1 024μg/mL浓度下溶血率仅为1.58%。上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性。从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因，将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPlC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86，测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌Gs115，经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达，SDSPAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68ku重组Bm86蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32％以上，诱导96h目的蛋白的表达量为0．36mg／mL。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达

为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。     

荣昌猪IFN-ω基因毕赤酵母表达载体的构建与表达

将荣昌猪IFN-ω基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,通过酶切、PCR鉴定表明成功构建了表达荣昌猪IFN-ω基因的酵母基因工程菌。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测,表明荣昌猪IFN-ω基因在毕赤酵母中实现了高效表达。表达产物在MDBK细胞上抗VSV的比活性为1.21×106U/mg,表明具有抗病毒活性。