槲皮素对K562/A02细胞株热休克蛋白mRNA及蛋白质表达的影响

目的了解槲皮素对K562/A02细胞株70kd热休克蛋白(HSP70)基因及蛋白质表达的影响.方法热处理前后加入终浓度为10μmol/L的槲皮素,RT-PCR方法检测HSP70基因mRNA表达,Western blot方法检测HSP70蛋白表达. 结果热处理明显增加K562/A02细胞HSP70基因mRNA转录和蛋白表达;热处理前加入槲皮素,HSP70基因mRNA及蛋白表达均显著下调;热处理后加入槲皮素,HSP70基因mRNA及蛋白表达无明显变化. 结论热处理能明显增加K562/A02细胞HSP70基因转录和蛋白表达;槲皮素能抑制K562/A02细胞HSP70基因mRNA及蛋白的表达,并且抑制点早于HSP70的基因转录;槲皮素在K562/A02细胞HSP70基因转录启动后则不再有抑制作用.     

槲皮素对K562/A02细胞多药耐药基因及糖蛋白表达的影响

目的：观察槲皮素对K562耐药细胞多药耐药基因及蛋白表达的影响，探讨其临床应用的可能性。方法：以浓度为0．5～100μmol／L的槲皮素处理K562／A02细胞，24h后，采用逆转录-多聚酶链反应(RTPCR)方法检测细胞内mdrl基因表达，应用流式细胞仪检测P糖蛋白(Pgp)含量变化。结果50μmol／L以上浓度处理组的mdrl基因表达较空白对照组明显下调。经0．5～100μmol／L槲皮素处理的K562／A02细胞荧光标记Pgp有随槲皮素浓度增加而减弱的趋势。结论：较高浓度的槲皮素可下调K562／A02细胞mdrl基因的表达。槲皮素可下调K562/A02细胞Pgp的表达。     

槲皮素对K562细胞形态及VEGF表达的影响

目的探讨槲皮素对K562细胞的形态、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白分泌和VEGF mRNA表达的影响.方法以K562细胞为研究对象,细胞形态学观察采用Wright's染色法;AnnecxinV标记检测细胞凋亡率;RT-PCR方法检测VEGF mRNA表达;ELISA法检测VEGF蛋白表达.结果1.经槲皮素处理后,细胞形态学上出现凋亡特征性改变;2.槲皮素处理后K562细胞凋亡率明显增加(P＜0.01);3.槲皮素能下调K562细胞VEGF mRNA的表达(P＜0.05);4.槲皮素处理后K562细胞显著降低VEGF蛋白的分泌(P＜0.05).结论槲皮素在体外能抑制白血病细胞K562生长并诱导其凋亡;槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF.     

槲皮素对K562细胞形态及VEGF表达的影响

目的探讨槲皮素对K562细胞的形态、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白分泌和VEGF mRNA表达的影响.方法以K562细胞为研究对象,细胞形态学观察采用Wright's染色法;AnnecxinV标记检测细胞凋亡率;RT-PCR方法检测VEGF mRNA表达;ELISA法检测VEGF蛋白表达.结果1.经槲皮素处理后,细胞形态学上出现凋亡特征性改变;2.槲皮素处理后K562细胞凋亡率明显增加(P＜0.01);3.槲皮素能下调K562细胞VEGF mRNA的表达(P＜0.05);4.槲皮素处理后K562细胞显著降低VEGF蛋白的分泌(P＜0.05).结论槲皮素在体外能抑制白血病细胞K562生长并诱导其凋亡;槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF.     

Genistein 对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响

目的 研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响。方法 用RT－PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡。结果 K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达阳性,用Genistein与K562细胞共同孵育后,bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2／M期,K562细胞出现凋亡。结果 bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,Genistein能使K562细胞生长受抑,诱导其调亡,抑制bcr-abl基因的mRNA表达,并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降,表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系。     

RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制

目的应用小分子干扰RNA（siRNA）技术抑制survivin基因的表达，观察其对K562细胞化疗敏感性的影响，为临床白血病治疗提供理论依据。方法实验分为RNA干扰组、脂质体对照组、空白对照组。转染48h后用RT—PCR法，免疫组化法分别检测survivin在mRNA及蛋白水平的表达；MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性；流式细胞仪检测细胞内阿霉素的药物浓度；免疫组化法检测K562细胞中3种耐药相关蛋白P—gP、TOPO-2、GST-π的表达。结果①RNA干扰组K562细胞的survivin基因表达水平明显下降；②RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性增高；③RNA干扰组K562细胞中阿霉素浓度增高；④RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达水平下降，而P-gP，TOPO-2的表达与对照组比较无显著差异。结论特异性siRNA能够有效抑制survivin基因的表达，并可能通过降低耐药蛋白GST-百的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。     

核糖体蛋白L6在K562/A02和K562细胞株中的表达差异

目的探讨核糖体蛋白L6（ribosomal proteinL6，RPL6）在急性髓细胞性白血病耐药细胞系K562／A02和敏感细胞系K562中的差异表达。方法分别从K562／A02和K562细胞中提取总RNA，以内参对照RT—PCR检测fuPL6基因表达。结果RPL6在飚62／A02细胞中的表达较K562高（P〈0．001）。结论在耐药细胞系K562／A02高表达RPL6可能与白血病耐药有关。     

汉防己甲素对白血病耐药细胞株K562/A02核因子κB表达的影响

目的：通过研究汉防己甲素（tetrandrine，Tet）对白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562／A02核因子kB（nuclear factor-kaPPaB，NF-kB）表达的影响，探讨Tet逆转多药耐药的作用机制。方法：采用免疫细胞化学及蛋白印迹法分别检测1umol／L Tet作用K562和K562／A02细胞6h和12h舌，细胞NF-kB核转位水平和胞核NF—kB蛋白表达的变化。结果：Tet作用6h和12h后，对K562细胞的NF-kB核转位水平及胞核NF—kB蛋白表达均无明显影响（P〉0．05）；K562／A02细胞NF—kB核转位水平及胞核NF—kB蛋白表达明显高于K562细胞对照组（P〈0．01）；Tet作用6h和12h后，可明显降低K562／A02细胞NF-kB蛋白核转位（P〈0．05）和胞核NF—kB蛋白表达水平（P〈0．01）。作用12h较作用6h效果更显著（P〈0．05）。结论：1umol／L Tet可能通过抑制NF—kB活化逆转K562／A02细胞多药耐药性。     

shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制.方法:针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1,2,3,采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞,RT-PCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1,MRP1,topoⅡ,GST的mRNA水平;蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平;MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50值).结果:K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞,差异有统计学意义(P<0.01),且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞;转染shRNA后,K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调,其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义(P<0.05),以shRNA3组下调最显著,并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调;转染48 h后K562/A02细胞中MDR1,MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调,以shRNA3组下调最显著,分别下调(39.7±1.21)%,(29.1±0.97)%,(28.2±1.04)%,GST基因表达则无明显变化;阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加,其中以shRNA3组最显著.结论:VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,不同干扰片段的沉默效果不同,并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,其机制可能与MDR1,MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系.     

HSP70/HSP90在鼻咽癌热疗后的表达变化及对热疗疗效影响的体外研究

目的 探讨体外鼻咽癌细胞系HNE1细胞热疗后热休克蛋白70/90(HSP70/HSP90)的表达变化及抑制HSP70/ HSP90表达对鼻咽癌热疗的影响,并初步探讨其机制.方法 对体外培养的鼻咽癌细胞HNE1,恒温水浴42 ℃热处理2 h,分别于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后荧光定量PCR检测HSP70/HSP90的基因表达变化,采用Western blot检测蛋白表达量的变化.流式细胞术检测细胞的凋亡,观察在热疗前应用槲皮素、格尔德霉素及联合应用对HSP70/HSP90表达抑制后,对HNE1细胞凋亡的影响.结果 42 ℃热疗后鼻咽癌细胞HSP70/HSP90表达在基因及蛋白水平上均有明显升高,4 h达到高峰,8 h后开始回落,24 h接近正常.槲皮素能抑制HSP70表达,但导致HSP90表达水平升高及下降延迟.热疗前使用槲皮素及格尔德霉素处理,凋亡细胞比例明显增加,联合处理组增加更为明显(P＜0.05).结论 HSP70/ HSP90在HNE1细胞内的表达均在热疗后迅速升高,在热疗前联合抑制HSP70/HSP90的活性,可以更有效增加热疗敏感性.     

恶性疟原虫不同虫株间环子孢子蛋白基因多态性分析

本文采用ＰＣＲ方法扩增了恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白（ＣＳＰ）部分基因，将扩增的基因片断克隆于Ｍ１３测序载体进行了基因序列测定。用ＰＣＧＥＮＥ软件对恶性疟原虫不同虫株ＣＳＰ基因序列进行了一系列比较分析。其结果表明恶性疟原虫虫株间ＣＳＰ基因存在多态性，ＰＦＤ－３／ＹＮ株ＣＳＰ基因序列与Ｔ４、Ｗｅｌｃｏｍｅ、ＮＦ５４、３Ｄ７及７Ｇ８等虫株均有不同程度的差异。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

SARS-Cov M蛋白的真核表达及其免疫原性研究

目的初步研究SARS-Cov病毒M蛋白基因的真核表达效率和免疫原性为进一步的疫苗研究奠定基础。方法以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长M基因,分别克隆至pcDNA4-his／myc和pVAON33载体获得重组质粒pcDNA4-his／myc-M和pVAON33-M。以Western Blot方法利用融合分子羧基段的myc表位检测pcDNA4-his／myc-M转染的293T细胞中M蛋白的真核表达。以ELISA方法检测pVAON33-M质粒基因免疫小鼠诱导产生特异性抗血清。结果pcDNA4-his／myc-M转染后48h可检测到SARS-Cov M蛋白表达。pVAON33-M基因免疫能够诱导产生M特异的体液免疫应答。结论本研究的结果表明SARS-Cov M蛋白可以在真核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以作为SARS-Cov疫苗研制的候选抗原之一。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

上颌窦鳞癌Bcl-2、Vegf、E-cad蛋白表达的临床意义

目的 探讨基因Bcl-2、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、上皮钙粘附素（epithelial-cadherin,E-cad）蛋白产物在上颌窦癌中的表达情况及其临床意义。方法 采用免疫组织化学方法,对55例上颌窦癌及20例正常鼻粘膜组织中基因Bcl-2、Vegf、E-cad蛋白产物进行检测。结果 1-Bcl-2在正常鼻腔粘膜组织中表达率为（10％）。上颌窦癌中有较高表达（58．1％）。Vegf在正常鼻腔粘膜组织中表达率（56．3％）明显高于上颌窦癌（30％）中表达;E-cad在正常鼻腔粘膜组织中表达率（80％）明显高于上颌窦癌（60％）;Bcl-2、Vegf、E-cad阳性表达在鼻腔粘膜组织与上颌窦癌组织之间相比,均具有显著性差异。2．Vegf蛋白阳性率随临床分期的增加而升高,其中Ⅲ～Ⅳ期阳性率（70．9％）明显高于Ⅰ～Ⅱ期（37．5％）Bcl-2和E-cad阳性率在Ⅰ～Ⅱ期（79．1％、75％）高于Ⅲ～Ⅳ期（41．9％、48．3％）两者差异有显著性,P〈0．05。结论 Bcl-2、E-cad、Vegf基因参与了上颌窦的癌变及发展过程,其表达水平是判断病情及制订合理的治疗方案的敏感基因学指标,具有重要的临床意义。     

融合蛋白 NrCAM-Fc的重组体的构建

目的：构建神经原相关的细胞粘附分子（NrCAM）和免疫球蛋白Fc片段融合基因的重组质粒并通过Baculovirus载体转染到昆虫细胞。方法：利用RT－PCR方法从神经母细胞瘤细胞系SK－N－SN获得NrCAM的信号肽区和跨膜区片段并直接克隆到pGEMT载体，经多次酶切、连接、转化、筛选获得NrCAM-Fc的重组副合基因，测序后将此基因通过Baculovirus载体转染至昆虫细胞。结果：多种酶切和测序结果表明NrCAM-Fc的序列与原序列符合率达98％以上，NrCAM与Fc连接处序列保证了Fc的读码框架（ORF）。结论：Baculovirus载体转染效率高，检测方法简便易行。     

肝癌患者syndecan-1基因蛋白的表达和意义

目的 :探讨syndecan 1蛋白与肝细胞肝癌的关系。方法 :应用免疫组化技术 (ABC法 )检测syndecan 1在肝细胞肝癌中的表达。结果 :发现在 31例肝癌组织中的syndecan 1阴性表达 18例 ,分化不良的肝癌syndecan 1阴性表达率高于分化较好者 (80 .0 %比 37.5 % ,P <0 .0 5 ) ;直径 >5cm的肝癌syndecan 1阴性表达率高于直径≤ 5cm肝癌 (85 9%比 35 3% ,P <0 .0 1) ;大体标本或镜下癌栓syndecan 1阴性表达率高于无癌栓的肝癌 (91 7%比 6 8% ,P <0 .0 1)。syndecan 1的阴性表达与患者的性别、年龄、血清甲胎球蛋白水平、乙型肝炎病毒感染、肝硬化有无、包膜的有无等因素均无明显的相关性 (P >0 .0 5 )。结论 :syndecan 1的低表达与肝癌增大、分化程度低、侵袭转移发生等恶性表型相关 ,可能对这些表型起负调节作用 ,可视其为抑癌基因。     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

纺锤体检查点蛋白Cenp-E在肝癌组织的表达及临床意义

目的观察纺锤体检查点蛋白（Cenp-E）在肝癌组织和人类正常肝组织表达水平的差异,以探讨Cenp—E蛋白在肝癌细胞中的表达反临床意义。方法用荧光定量PCR和Westernblot分别检测Cenp．E基因和蛋白在肝癌组织和正常肝组织的表达水平。结果正常肝组织中Cenp-E基因mRNA水平（0．02378±0．00973）明显高于肝癌组织（0．01458±0．00873）;Cenp—E蛋白表达量在正常肝组织中（0．656±0．012）明显高于在肝癌组织中的表达（0．301±0．009）,且二者有显著性差异。结论Cenp—E低表达在肝癌的发生过程中起重要作用。     

PCR扩增日本血吸虫大陆株黏蛋白样蛋白(SjMLP)部分基因

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株黏蛋白样蛋白(SjMLP)的部分基因序列。方法 利用PCGENE软件查找SjMLP的抗原决定簇；特定寡核苷酸引物的设计与合成；TROZOL抽提日本血吸虫成虫总RNA，RT—PCR扩增目的基因并进行DNA度列分析。结果 RT—PCR特异性扩增出SjMLP编码区部分基因序列，大小为756bp，测序结果显示与曼氏血吸虫MLP高度同源。结论 扩增到了SjMLP抗原编码区基因的部分序列，与Sm MLP高度同源。