大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—LacZ融合基因的构建

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ＰＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬＡＣＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇＩＩＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ＰＵＣ１８ ＤＮＡ与１４７ ｂｐＳＴ１ ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化不受体菌ＤＨ５Ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STⅠ和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%.     

大肠杆菌耐热性肠毒素的研究进展

随着分子生物学的发展 ,近年来 ,对大肠杆菌耐热性肠毒素的研究已从细胞水平 ,分子水平进入基因水平 ,在其分子结构与功能、理化特性、提纯方法与鉴定、致病机理、分子生物学等方面进行了大量的研究 ,本文就大肠杆菌耐热性肠毒素的研究概况作一简要的介绍。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别.     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％,而且无天然ＳＴ１生物毒性。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶Ｅｃｏ ＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素1—β半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ｉ（ＳＴＩ）结构基因的质粒ＰＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴＩ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因的载体ＰＵＣ１８用ＢａｍＨＩ消化、碱性磷酸酶处理、然后将处理的ＰＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴ１ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶酶性进粘末端连接。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

表达大肠肝菌耐热性肠毒素I融合蛋白基因工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌对耐热怀肠毒素Ｉ（ＳＴ１）－β－半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）经乳鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体，再辅以氢氧化铝胶制备抗原，免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ鼠，获得抗融全蛋白抗体，乳鼠灌胃中和试验结果表明，该抗体能中和天然ＳＴ１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性ＢＡＬＢ／ｃ鼠产下的乳鼠吮吸初乳后，能够抵抗１个鼠活性     

产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究进展

肠毒素大肠杆菌是导致婴幼儿及旅游者急性腹泻,仔猪腹泻和水肿的主要病原菌之一。菌毛定居因子是该病原菌主要的致病因素。DNA疫苗既能激发机体的细胞免疫,也能诱导特异性的体液免疫。目前用于预防ETEC腹泻的DNA疫苗的研究已取得一定进展,作者从重组质粒的构建、免疫应答、疫苗的接种系统以及基因佐剂4个方面简单的概述了产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗的研究现状。     

用杂交基因探针检测埃希氏大肠杆菌分离株的肠毒素,志…

用单克隆杂交技术检测了纽约州６６６头牛及５７头猪分离的埃希氏大肠杆菌的肠毒素（ＳＴａＰ，ＳＴｂ，ＬＴ，ＳＬＴ－１及ＳＬＴ－Ⅱ）和粘着素（Ｋ８８，Ｋ９９，Ｆ４１，９８７Ｐ）。有３６７株牛源分离株（４５．２％）至少能与一个基因探针杂交，其中２２３株（３３．２％）与Ｆ４１、１１２株（１６．７％）与Ｋ９９、８２株（１２．２％）与９８７Ｐ，９６株（１４．３％）与ＳＴａＰ，７株（１．１％）与ＳＴｂ杂交。能与Ｋ     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。