人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP 1的OD值。结果 :获得初步纯化的兔抗人MMP 1特异性多克隆抗体 ,该抗体能与人MMP 1起反应。结论:制备的MMP 1多克隆抗体可初步用于临床检测     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

Tau40蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的快速纯化tau蛋白，制备tau蛋白的多克隆抗体。方法依次使用差速离心、热失活、离子交换层析的方法纯化体外重组的人tau蛋白；用此纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用Western blot检测组织来源的样品，确定所制备抗体的特异性和效价。结果采用上述方法成功获得人类全长tau蛋白——tau 40；同时，所制备的tau蛋白多克隆抗体效价高，特异性好。结论本方法所获得的tau抗体效价高，特异性好，可以用于进一步的科学研究。     

镉诱导金属硫蛋白的纯化及其抗体制备

建立简便分离纯化镉诱导金属硫蛋白的方法，并制备抗Ｃｄ－ＭＴ抗血清。方法；采用加长Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５柱层析分离纯化由ＣｄＣｌ２诱导的大鼠肝组织Ｃｄ－ＭＴ，以此为抗原免疫家兔制得抗Ｃｄ－ＭＴ抗血清。结果：纯化后的Ｃｄ－ＭＴ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定相对分子质量及Ｃｄ含量测定与标准Ｃｄ－ＭＴ一致，氨基酸组分分析也与文献报道基本一致；     

斑马鱼ISL1蛋白多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究ISL1作为第二生心区心脏前体细胞的分子标志在心脏发育中的功能,需要获得ISL1蛋白并制备其抗体。方法 根据已报道的ISL1基因序列,以斑马鱼mRNA为模板进行PCR扩增得到ISL1部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。将重组质粒进行酶切测序鉴定,然后利用大肠杆菌E．coli BL21对该重组质粒进行表达。经过IPTG诱导,采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的his-ISL1融合蛋白免疫新西兰大白兔制备ISL1多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价。结果获得了ISL1原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ISL1多克隆抗体。结论本实验为ISL1在斑马鱼心脏发育中的新功能的进一步研究奠定了基础。     

HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法 利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp（384～661aa）的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a（＋）,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果 用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论 成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶（GST）-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体。方法 质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清。结果 在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白。应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体。结论 通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件。     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

人致病性呼肠孤病毒M3编码蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的  根据构建的人致病性纳尔逊海湾病毒（NBVs）M3基因片段质粒,纯化融合蛋白制备NBVs M3多克隆抗体。方法  利用构建的纳尔逊海湾病毒（NBVs）M3基因质粒Pris His MB-M3,转化至大肠埃希菌（E.coil）BL21（DE3）感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,产物经过镍柱亲和层析法获得Pris His MB-M3融合蛋白;将纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔,获得NBVs M3多克隆抗体;蛋白免疫印迹检测（Western blot）蛋白准确性以及多克隆抗体抗性。结果  SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色检测显示：25℃、IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导12 h,Pris His MB-M3融合蛋白表达量最高;在咪唑浓度为MCAC-20、MCAC-40条件时洗脱下目的蛋白。用纯化的融合蛋白免疫家兔制备抗体,Western blot验证成功制备出NBVs M3多克隆抗体。结论  成功获得了灵敏性及特异性较高的纳尔逊海湾病毒（NBVs）M3多克隆抗体,为进一步研究该病毒的致病性提供了很高的应用价值。

     

GST-Gankyrin融合蛋白的原核表达及抗体制备

目的:为进一步研究在肝癌上过表达的癌相关基因Gankyrin的功能,进行GST-Gankyrin融合蛋白表达载体的构建、原核表达、及抗体制备.方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人肝癌细胞系hepG2中扩增Gankyrin Cdna编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒Pgex-4T2中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌DH-5α,经IPTG诱导获得表达,并将Gankyrin蛋白免疫家兔,经过Western blot检测抗Gankyrin抗体的产生.结果:成功构建了Gankyrin原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,Western blot检测证实获得了抗Gankyrin抗体.结论:成功表达了Gankyrin蛋白并制备了其特异性抗体.     

人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的：将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1（XBP1u）的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法：重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l（DE3）,在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2＋-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果：XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论：成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.     

脆性组氨酸三联体基因与HIV-TAT蛋白转导域融合蛋白表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：制备脆性组氨酸三联体（FHIT）基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白FHIT/TAT以及该融合蛋白的兔抗多克隆抗体,探讨FHIT基因对肝肿瘤的作用及其机制.方法：构建FHIT基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白表达载体,确定该载体的最佳诱导表达条件,在大肠杆菌中大量表达并获得纯化的FHIT/TAT融合蛋白,同时以该融合蛋白免疫兔制备抗FHIT/TAT融合蛋白的多克隆抗体.结果：构建了FHIT基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白表达载体;确定了该载体的最佳诱导表达条件;Western Blot检测也证实了该融合蛋白在大肠杆菌中的表达;以此为基础在大肠杆菌中大量表达并获得了70%纯度的FHIT/TAT融合蛋白;同时制备了较高滴度的兔抗FHIT/TAT融合蛋白多克隆抗体.结论：成功建立了制备具有高效转导作用的HIV-TAT蛋白转导域与FHIT基因融合蛋白的原核表达体系,获得了该融合蛋白的兔抗多克隆抗体,为FHIT基因对于肝肿瘤的作用及其机制研究,特别是肝肿瘤的基因治疗和预防等打下了良好的基础.     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的:纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测.方法:采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用.结果:获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用.结论:获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性.     

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的 利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析.方法 将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性.结果 转化溶原菌后能够表达目的 蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白.Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性.结论 利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复.     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程,选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备,并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板,构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白,并纯化。利用蛋白质免疫印迹,蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示,成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中,考马斯亮蓝染色检测,相较于诱导前,加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达,且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明,制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示,相较于对照组,制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性,结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒,利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白,利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白,为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白，并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法 从肝癌细胞系HepG2提取总RNA，用RT-PCR扩增出PPARγC1 cDNA的编码序列，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，重组载体在酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白，SDS-PAGE分析表达产物，通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白，并以此为抗原制备多克隆抗体。Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果 经测序、酶切鉴定证明，PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体，为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。