小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的：探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。 方法： 采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mRNA水平，检测其oct-4基因表达，并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞，基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结果： 小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形，细胞核大，胞质少；细胞增殖能力尚可；细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-；有oct-4基因表达；诱导分化后，可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结论： 成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定***☆

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。 目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。 方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。 结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1∶3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。 关键词：单克隆培养;骨髓基质干细胞;多能成体干细胞;鉴定;分化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.008     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。 目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。   方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。 结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

背景：兔来源的骨髓间充质干细胞是具有较强的体外增殖和多系统分化潜能的成体干细胞,在组织工程及生物治疗领域蕴藏着巨大的潜能。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察骨髓间充质干细胞的生物学特征。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。在显微镜下观察细胞形态特征及生长规律,流式细胞技术检测细胞表面抗原标记物的表达。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经过细胞传代后能够获得进一步纯化的细胞,杂质细胞减少。原代细胞形态即呈现三角形、长梭形、纺锤形的贴壁细胞特征。第 5代骨髓间充质干细胞呈典型的极性漩涡状生长,形态单一均匀,不具有表达造血前体细胞表面标志抗原CD34和白细胞表面标志抗原CD45的表面标记物功能,但是具有能够表达出整合素家族的成员 CD29 及黏附分子CD44的特点。说明经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经流式细胞分析鉴定为兔骨髓间充质干细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因Beclin-1的表达

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,但是经过长期体外培养后,骨髓间充质干细胞增殖分化能力逐渐丧失,其机制仍不明确。目的：观察人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化过程中自噬相关基因表达的变化。方法：利用表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,观察其形态变化及生长情况。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达,采用Western blot检测诱导前后人骨髓间充质干细胞自噬相关基因Beclin-1表达的变化。结果与结论：经诱导后,人骨髓间充质干细胞呈典型神经元样细胞分化,神经元特异性烯醇化酶阳性率为78.7%,胶质纤维酸性蛋白阳性率为8.1%。诱导0.5 h后处理组细胞中Beclin-1的表达水平有所增加,但1 h后开始逐渐降低。说明体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,自噬相关基因表达活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。 目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。 方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。 结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中miR130α的表达

目的诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,初步探索miR130a在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的调控作用。方法体外TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,免疫荧光法和免疫组化染色鉴定Ⅱ型胶原,阿辛兰染色鉴定氨基葡聚糖。用Real-time PCR法检测细胞miR130a的表达。结果骨髓间充质干细胞在TGF-β1诱导下可分化为软骨细胞。培养7 d后,诱导培养组细胞miR130a表达的水平显著低于培养前的水平(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞体外诱导可以分化为软骨细胞,在向软骨细胞分化的早期,miR130a表达降低伴随着软骨细胞的分化,提示与软骨形成的过程有关。     

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。 目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。 方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。 结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24 h内贴壁,培养5~7 d 后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G₀/G₁,S和G₂/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓间质干细胞的生物学特征的研究

目的： 研究不同来源（正常人、慢性粒细胞性白血病）骨髓间质干细胞的生物学特征及分化能力。 方法: 分离获取19例慢性粒细胞性白血病（CML）患者的骨髓间质干细胞，同时获取8例正常人的骨髓间质干细胞作为对照。获取的间质干细胞采用低血清培养液培养。瑞士染色观察形态，FACS检测其免疫表型和细胞周期，通过油红O和von Kossa染色来证实向脂肪和骨的分化情况。RT-PCR检测CML特异性表达的BCR/ABL基因；对正常人、CML患者的骨髓间质干细胞进行染色体分析。 结果: 正常人和CML骨髓间质干细胞具有相似的细胞形态、生长特性和免疫表型，而且都可以向骨和脂肪分化。CML来源的MSCs不表达BCR/ABL融合基因，并且具有正常的核型。 结论: 从CML骨髓中可以分离和培养出具有间质干细胞特性的细胞群体，其具有正常的核型且不表达BCR/ABL基因。CML和正常人骨髓间质干细胞具有相似的生物学特性和多向分化能力。     

Expansion of mesenchymal stem cells from human pancreatic ductal epithelium

Fibroblast-like cells emerging from cultured human pancreatic endocrine and exocrine tissue have been reported. Although a thorough phenotypic characterization of these cells has not yet been carried out, these cells have been hypothesized to be contaminating fibroblasts, mesenchyme and/or possibly beta-cell progenitors. In this study, we expanded fibroblast-like cells from adult human exocrine pancreas following islet isolation and characterized these cells as mesenchymal stem cells (MSCs) based on their cell surface antigen expression and ability to differentiate into mesoderm. Analysis by flow cytometry demonstrated that pancreatic MSCs express cell surface antigens used to define MSCs isolated from bone marrow such as CD13, CD29, CD44, CD49b, CD54, CD90 and CD105. In addition, utilizing protocols used to differentiate MSCs isolated from other somatic tissues, we successfully differentiated pancreatic MSCs into: (1) osteocytes that stained positive for alkaline phosphatase, collagen, mineralization (calcification) and expressed osteocalcin, (2) adipocytes that contained lipid inclusions and expressed fatty acid binding protein 4 and (3) chondrocytes that expressed aggrecan. We also demonstrated that pancreatic MSCs are multipotent and capable of deriving cells of endodermal origin. Pancreatic MSCs were differentiated into hepatocytes that stained positive for human serum albumin and expressed endoderm and liver-specific genes such as GATA 4 and tyrosine aminotransferase. In addition, preliminary protocols used to differentiate these cells into insulin-producing cells resulted in the expression of genes necessary for islet and beta-cell development such as Pax4 and neurogenin 3. Therefore, multipotent MSCs residing within the adult exocrine pancreas could represent a progenitor cell, which when further manipulated could result in the production of functional islet beta-cells.     

髓核细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化

背景：骨髓间充质干细胞近年来作为种子细胞被广泛应用于髓核组织工程。在诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞分化的过程中,需要提供适当的细胞外微环境以及生长因子。 目的：研究体外与髓核细胞非接触共培养和生物诱导剂条件下,兔骨髓间充质干细胞向类髓核样软骨细胞分化的可行性。 方法：用单层培养法分别分离培养兔骨髓间充质干细胞和髓核细胞。选用第3代的髓核细胞和骨髓间充质干细胞置于Transwell培养皿上下层构建共培养体系并加入转化生长因子β1为主的生物诱导剂诱导培养21 d,以高糖DMEM培养基单独培养的骨髓间充质干细胞作为阴性对照。 结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞细胞表面CD29和CD44表达阳性,CD34、CD45的细胞表达阴性。与髓核细胞共培养诱导21 d后,可观察到骨髓间充质干细胞形态向多角形类圆形转变,胞质中分泌Ⅱ型胶原颗粒明显增多,RT-PCR结果表明诱导后细胞中Ⅱ型胶原mRNA表达明显增高。结果说明骨髓间充质干细胞在与髓核细胞共培养加生物诱导剂条件下可成功诱导分化为类髓核细胞。     

小鼠骨髓来源Flk-1+间充质干细胞分离制备与生物学特点

背景：骨髓间充质干细胞具有广泛的应用前途,其三系分化的能力和免疫诱导特性使其具有再生医学的应用前景。 目的：从小鼠骨髓中研究分离制备Flk-1⁺间充质干细胞的新方法,检测了这类细胞的生物特性。 方法：以小鼠骨髓为研究对象,分离单个核细胞,体外培养并 扩增原始间充质干细胞,检测它们的细胞周期、表型和多系分化的能力。 结果与结论：小鼠来源的骨髓来源的原始间充质干细胞呈成纤维样生长,大部分细胞处于G₀/G₁期,并且高表达Flk1,CD13,CD29,CD44,小鼠骨髓来源Flk-1⁺间充质干细胞在光镜下均呈成纤维样或多角型贴壁生长,在体外相应的诱导液环境中均可以向三系分化。提示小鼠骨髓来源Flk-1⁺间充质干细胞具有多向分化潜能。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。 目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。 结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P < 0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells able to differentiate along different pathways including chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. MSCs with a fibroblast-like morphology have been identified in human fetal lung. However, their frequency and characterization in human adult lung have not been yet evaluated. Therefore, we analyzed the mesenchymal phenotype and differentiation ability of cultured human adult bronchial fibroblast-like cells (Br) in comparison with those of mesenchymal cell progenitors isolated from fetal lung (ICIG7) and adult bone marrow (BM212) tissues. Surface immunophenotyping by flow cytometry revealed a similar expression pattern of antigens characteristic of marrow-derived MSCs, including CD34 (-), CD45 (-), CD90/Thy-1 (+), CD73/SH3, SH4 (+), CD105/SH2 (+) and CD166/ALCAM (+) in Br, ICIG7 and BM212 cells. There was one exception, STRO-1 antigen, which was only weakly expressed in Br cells. Analysis of cytoskeleton and matrix composition by immunostaining showed that lung and marrow-derived cells homogeneously expressed vimentin and nestin proteins in intermediate filaments while they were all devoid of epithelial cytokeratins. Additionally, alpha-smooth muscle actin was also present in microfilaments of a low number of cells. All cell types predominantly produced collagen and fibronectin extracellular matrix as evidenced by staining with the monoclonal antibodies to collagen prolyl 4-hydroxylase and fibronectin isoforms containing the extradomain (ED)-A together with ED-B in ICIG7 cells. Br cells similarly to fetal lung and marrow fibroblasts were able to differentiate along the three adipogenic, osteogenic and chondrogenic mesenchymal pathways when cultured under appropriate inducible conditions. Altogether, these data indicate that MSCs are present in human adult lung. They may be actively involved in lung tissue repair under physiological and pathological circumstances.     

Jagged1蛋白抑制神经干细胞向神经元分化的实验

目的：研究Jagged1蛋白对神经干细胞分化的影响。方法：分离小鼠胚胎脑神经干细胞,用Jagged1蛋白、Jagged1蛋白 γ泌肽酶体外诱导神经干细胞分化,观察分化后神经元所占的比例。结果：分离的细胞能持续增殖,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;在Jagged1蛋白的影响下,分化后神经元数量明显减少;γ泌肽酶抑制剂能阻断Jagged1蛋白的诱导作用。结论：培养的细胞为神经干细胞,并表达Notch受体;Jagged1蛋白能抑制干细胞向神经元分化,这种分化作用是通过Notch受体实现的。