改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体的构建及表达

目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.     

PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定

目的 构建融合蛋白PTD－Calbindin D28K(CaBP28)的表达质粒，并进行诱导表达、纯化，在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法提取大鼠脑组织总RNA，反转录后用聚合酶链反应(PCR)法扩增编码CaBP28的全长cDNA序列，重组入pET-32a及含有PTD的pTrans Vector表达载体中，测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后，以NTA-Ni亲和层析柱进行分离纯化，SDS-PAGE以及Western blot鉴定。纯化的CaBP28及PTD-CaBP28用FITC标记，分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞，最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况，并用流式细胞仪(FCM)做定量分析。结果成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP28表达载体，插入片断。783bp，表达产物相对分子质量分别约30000、50000，经Wetern blot鉴定，与抗CaBPD28K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后，CaBP28-FITC仅少量吸附于细胞膜表面，而PTD-CaBP28-FITC则分布于胞质内；FCM定量分析发现，细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加，并且孵育时间为1h时荧光达到最强。结论重组PTD-CaBP28具有良好的细胞穿膜功能。     

肝型脂肪酸结合蛋白基因的原核表达、纯化和鉴定

目的 克隆肝型脂肪酸结合蛋白(LFABP)基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从cDNA中扩增出LFABP基因片段,通过酶切和连接,构建原核表达载体pET-m-LFABP,转化入E.Coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达;应用亲和层析、凝胶过滤层析和 Lipidex1000 凝胶层析分级纯化目的蛋白.圆二色谱分析检测目的蛋白的二级结构和热稳定性.结果 SDS-PAGE 分析表明,表达产物的相对分子质量约为15×103,与理论值相一致;应用亲和层析、凝胶过滤层析和 Lipidex1000 凝胶层析分级纯化目的蛋白,得到纯度较高的蛋白.蛋白的圆二色谱分析表明在大肠杆菌中表达的LFABP蛋白可以形成正确的折叠,热稳定性检测结果表明 LFABP 蛋白在高温下具有较高的稳定性.结论 利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究脂肪酸结合蛋白 LFABP 的生物学特性、参与脂肪酸代谢调控及其机制研究、与药物的相互作用提供重要基础和研究依据,并将为相关疾病的治疗奠定基础.     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白可溶性表达产物的纯化及活性鉴定

目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌HspA UreB融合蛋白可溶性表达产物的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌BL2 1(pET HU2 7)诱导表达产物 ,超声破碎后收集上清 ,上清经盐析初步纯化后 ,在 ¨AKTAFPLC上运用HiTrapChelatingHP分离纯化 ,用SDS PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用West ern blot对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后HspA UreB融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 15mg/ml,并可以被免疫小鼠血清识别。结论 :建立了从BL2 1(pET HU2 7)可溶性表达产物中纯化高纯度HspA UreB融合蛋白的方法 ,为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。     

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 获得融合TAT短肽的融合蛋白GST—TAT-GFP，以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法 以质粒pGEX—GFP为模板，扩增目的基因TAT—GFP，将其克隆至质粒pGEX-2T，用所构建的质粒pGEX—TAT—GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达，利用GS-4B亲和柱进行纯化，所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54．3kD的蛋白，其相对分子质量与GST—TAT-GFP融合蛋白相符；Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别；细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论 在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST—TAT—GFP融合蛋白。     

重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的：构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体,高效表达IL-33蛋白。方法：采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）mRNA中扩增IL-33 cDNA;将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。结果：扩增的IL-33 cDNA大小为800bp左右。表达的IL-33融合蛋白大小为45kDa左右,Western blotting鉴定显示表达的蛋白正确,为IL-33目的蛋白。但表达的大部分蛋白为无生物学活性的包涵体,在后续对表达蛋白进行纯化的同时对蛋白进行了复性,得到了复性后具有生物学活性的IL-33蛋白。结论：成功制备了具有生物学活性的IL-33蛋白。     

人OX40融合蛋白的表达及其纯化

目的表达含有人OX40胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为下一步制备抗人OX40单克隆抗体及鉴定打下良好的基础。方法采用冰冷热击法将测序正确的pET32a—OX40胞外段的重组质粒转入表达菌株BL21（DE3）的感受态细胞,接种于含氨苄青霉素的培养基筛选出阳性克隆。将阳性克隆细菌用IPTG诱导培养,收集不同时间的培养产物,离心分离菌体,取菌体超声破菌,离心收集胞质上清和包涵体沉淀,进行SDS．PAGE分析,观察不同时间条件对目的蛋白表达的影响及目的蛋白分布情况,筛选优化表达条件。采用Ni离子亲合层析柱纯化目的蛋白,然后使用超滤管对蛋白进行脱盐处理,并用核酸蛋白检测仪测定目的蛋白的浓度。结果筛选到表达pET32a．OX40的阳性菌株。SDS．PAGE电泳表明,含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后,在蛋白Marker的31．0～42．7kD之间出现了新的融合蛋白带,在胞质和包涵体中均有目的融合蛋白的表达。优化表达条件分析表明,在诱导的不同时间内新蛋白的表达量没有明显差别。用Ni离子亲和层祈柱纯化的蛋白经超滤管进行脱盐处理后,获得的目的蛋白含量为56．266g／L。结论成功获得表达pET32a—OX40的阳性菌株;表达产物经Ni离子亲和层析柱层析处理可获得纯度较高的目的蛋白。     

HEV-GST融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用谷胱苷肽转移酶（GST）蛋白纯化系统表达、纯化和鉴定HEN-GST融合蛋白.方法 将标记有GST的重组大肠杆菌E.coli BL21诱导表达HEV-GST融合蛋白,采用GST蛋白纯化系统进行纯化、所得产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.结果 大肠杆菌细胞高效表达出约43Kd蛋白,其分子量与HEV-GST分子量相符,经Western Blot显示所纯化蛋白能被抗GST抗体识别.结论 GST大肠杆菌表达系统中高效表达的HEV-GST融合蛋白可用于临床及实验研究.     

GST-Fank1融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

 摘要 目的： 研究转录因子Fank1与GST融合蛋白原核表达载体的构建和表达。方法： 根据编码Fank1蛋白的DNA序列,经引物设计软件Primer Premier 5.0优化设计出上下游引物（Ⅰ,Ⅱ）,同时在5′端引入BamHⅠ酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以pdsRED-Fank1质粒为模板进行PCR扩增Fank1目的片段,经限制性内切酶酶切后连接到原核表达载体pGEX4T-2, 构建成pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导进行目的蛋白表达。 结果： 经菌液PCR、电泳分析及测序证明成功构建了Fank1融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹显示,相对分子量为44KD的蛋白条带,与预期一致。 结论： 成功构建了pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,并在原核细胞中有表达,为进一步研究转录因子Fank1的功能奠定了基础。     

硫氧还蛋白-(His)6融合的瑞替普酶的表达、纯化和活性检测

目的:构建硫氧还蛋白-(His)6-瑞替普酶融合表达载体,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量,简化rPA的分离纯化.方法:将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白-(组氨酸)6标签下游,在大肠杆菌BL21(DE3)中用乳糖进行诱导表达.采用一步稀释法对融合蛋白体外复性后,使用Ni2 亲和层析柱,对包涵体复性液进行初步纯化.采用体外溶圈法对复性后和纯化后的融合蛋白进行生物活性的测定.结果:得到分子量约为56 kDa的融合蛋白,表达量达到总蛋白的30%以上.比本实验室构建的非融合表达载体表达量提高了约50%.经过一步Ni2 亲和层析,融合蛋白纯度达到80%以上.体外溶圈法实验表明融合蛋白复性后和纯化后具有溶栓活性.结论:与非融合表达相比,融合表达的表达量明显提高.即使N端额外融合一段融合多肽,rPA仍然具有生物学活性.     

Expression, Purification, and Refolding of Recombinant Fusion Protein hIL-2/mGM-CSF

To study the activities of interleukin (IL)-2 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (hIL-2/mGM-CSF).Methods SOE PCR was used to change the linker of the fusion protein for higher activities.The fusion protein was expressed in Escherichia coli (E.coli) BL21 (DE3) in inclusion body (IB) form.After IB was extracted and clarified,it was denatured and purified by affinity chromatography.The protein was refolded by dilution in a L-arginine refolding buffer and refined by anion chromatography.The protein activity was detected by cytokine-dependent cell proliferation assay Results The expression of hlL-2/mGM-CSF in E.coil yielded approximately 20 mg protein/L culture and the purity was about 90%.The specific activities of IL-2 and GM-CSF were 5.4×106 IU/mg and 7.1×106 IU/mg,respectively.Conclusion This research provides important information about the anti-tumor activity of hIL-2/mGM-CSF in vivo,thus facilitating future clinical research on hIL-2/mGM-CSF used in immune therapy.     

Expression, Purification, and Refolding of Recombinant Fusion Protein hlL-2/mGM-CSF

Objective To study the activities of interleukin （IL）-2 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor （GM-CSF） （hlL-2/mGM-CSF）. Methods SOE PCR was used to change the linker of the fusion protein for higher activities. The fusion protein was expressed in Escherichia coli （E. coil） BL21 （DE3） in inclusion body （IB） form. After IB was extracted and clarified, it was denatured and purified by affinity chromatography. The protein was refolded by dilution in a L-arginine refolding buffer and refined by anion chromatography. The protein activity was detected by cytokine-dependent cell proliferation assay. Results The expression of hIL-2/mGM-CSF in E. coli yielded approximately 20 mg protein/L culture and the purity was about 90%. The specific activities of IL-2 and GM-CSF were 5.4×10^6 IU/mg and 7.1×10^6 IU/mg, respectively. Conclusion This research provides important information about the anti-tumor activity of hIL-2/mGM-CSF in vivo, thus facilitating future clinical research on hlL-2/mGM-CSF used in immune therapy.     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。     

GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDAXX，并在HeLa细胞中表达，为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础。方法:用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP，筛选阳性克隆。将质粒pEGFP／hDaxx转染HeLa细胞，Western-Blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位。结果：成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核。结论:GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核。     

抗癫痫肽/GST融合表达及包涵体蛋白复性纯化

[目的]获得高纯度的谷胱甘肽硫转移酶/抗癫痫肽(GST-AEP)融合蛋白。[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法定量。[结果]从融合蛋白包涵体中获得了纯度达90%以上的目的蛋白,定量约0.163μg/μl。[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体GST-AEP的方法,为对AEP进一步的相关研究奠定了基础。