我国茶树遗传育种的一项重要突破浙江大学茶学系克隆茶树多酚氧化酶基因获得成功

日前,在浙江大学博士学位论文答辩会上,茶学系在职博士研究生赵东的博士论文“茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统的研究”得到了专家的高度评价.该项研究采用nest PCR技术在国际上首次成功地克隆出与茶叶品质、人体健康密切相关的茶树多酚氧化酶基因,并在GenBank(美国国家生物技术信息中心核苷酸数据库)登录,开创了我国茶树育种研究的新领域.     

甘薯多酚氧化酶保守区的cDNA克隆及序列分析

多酚氧化酶是植物体内广泛存在的铜结合酶,催化一元酚或多元酚氧化生成“黑色素”,是引起果蔬等农产品褐变的主要原因。通过对已克隆的植物多酚氧化酶基因的分析,设计了一对简并引物,ＰＣＲ扩增了甘薯多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ,序列分析结果表明,该ｃＤＮＡ含有５９１个核苷酸,编码１９７个氨基酸,与已发表的其它植物的多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ具有很高的同源性。     

PCR-SSCP-银染法在茶树基因突变分析中的应用

将医学领域广泛应用的检测基因突变的PCR-SSCP-银染法应用于茶树基因遗传变异分析,建立了茶树PCR-SSCP-银染检测技术体系.根据茶树多酚氧化酶(PPO)基因的部分序列设计引物,对40个茶树品种(系)PPO基因的部分序列分区段进行PCR-SSCP分析.结果表明,不同茶树品种(系)的PPO基因存在丰富的单链构象多态性,所建立的方法体系具有较高的灵敏度与分辨率,适合于多样品在DNA测序前进行基因型分型,也可应用于茶树基因的遗传多态性分析.     

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。     

茶多酚酶细胞内定位及其与红茶色素形成的研究进展

1947年Lien Plao Li和J.Bonner把酶定位巧妙地与其功能研究结合起来,证明茶树多酚酶主要存在于叶绿体片层结构,跟同时获得的多酚酶不是末端氧化酶的结果相吻合。可是,1966年Tadakazu Takeo否定了上述观点,认为茶树体内的多酚酶是定位于线粒体,氧化酶同线粒体联系似乎更合常理。然而由于研究方法等方面的问题,茶树多酚酶的胞内定位尚值得商讨。     

植物多酚氧化酶分子生物学研究进展

本文综述了近年来植物多酚氧化酶在分子生物学如分子结构,分子量,基因克隆、结构、特征与表达调控等方面的研究进展以及植物多酚氧化酶的应用前景。     

茶叶中多酚氧化酶及其同功酶的研究概况

茶叶中存在着活跃的多酚氧化酶,它在茶树的呼吸代谢中起了重要的末端氧化酶的作用。在茶叶加工中多酚氧化酶对多酚类物质的氧化变化起了积极的催化作用,这是茶叶品质形成的重要因素。本文就茶叶中多酚氧化酶及其同功酶的研究概况作一些综合介绍和讨论。     

植物多酚氧化酶分子生物学研究进展

本文综述了近年来植物多酚氧化酶在分子生物学如分子结构,分子量,基因克隆、结构、特征与表达调控等方面的研究进展以及植物多酚氧化酶的应用前景.     

植物多酚氧化酶分子生物学研究进展

本综述了近年来植物多酚氧化酶在分子生物学如分子结构，分子量，基因克隆、结构、特征与表达调控等方面的研究进展以及植物多酚氧化酶的应用前景。     

基于茶树品种酶活性的鲜叶混合加工工夫红茶品质比较

为了提升湖南中小种工夫红茶品质,在测定湖南省茶叶研究所选育的茶树品种多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的基础上,采用传统工艺,以茶树良种槠叶齐和碧香早鲜叶为原料进行混合加工试验,对样品感官审评和生化检测。结果表明:不同茶树品种多酚氧化酶和过氧化物酶活性差异大,其加工的工夫红茶品质差异明显;采取不同品种鲜叶混合加工,能有效提高中小叶种工夫红茶的品质。     

毛栓菌多酚氧化酶酶学性质及茶黄素的酶促合成研究

研究从毛栓菌中分离得到的多酚氧化酶(PPO)用于茶黄素的体外氧化制备。结果表明毛栓菌胞外PPO较适的反应温度范围在28~36℃之间;最适pH值为5.2;恒温反应30min内均表现出较高的活性和稳定性;50%的硫酸铵可以沉淀粗酶液中96.0%的PPO。将毛栓菌PPO加入到儿茶素反应液中进行双液相反应,可得到10.19%的茶黄素,与茶鲜叶来源的PPO相比,毛栓菌PPO制备茶黄素的总含量偏低,但其中TF-3-G的比例较高,达到总茶黄素的68.10%,占脂型茶黄素总量的92.08%。     

茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达

以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。     

茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展

多酚氧化酶（PPO）是茶树生理与茶叶加工中的一类重要氧化还原酶,也是茶黄素及其组分酶促合成中的关键酶。从PPO结构分类、同工酶、PPO与茶叶品质关系、PPO分离纯化及酶促合成茶黄素等方面进行综述,以期为茶树品种适制性评价、茶黄素及其组分高效制备以及PPO同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。     

铜与锌对茶树生育特性及生理代谢的影响——Ⅰ.铜对茶树的生长和生理效应

采用大田和盆栽试验相结合的方法,通过调查测定茶树生育特性、多酚氧化酶和硝酸还原酶活性、碳氮代谢的变化等,研究了铜对茶树的生长和生理效应。结果表明,适宜的施铜量能促进茶树生长,特别是对新梢和吸收根具有明显的刺激作用,并能增强体内氧化还原酶促反应和碳氮合成代谢,从而提高产量,改善品质。但过量施铜,在叶面喷施时,新梢的萌发和生长受抑制;在土施时,吸收根数量明显减少。过量施铜还会引起酶活性的降低、碳氮代谢的方向发生变化等,从而导致茶叶产量和品质的下降。文中还对茶树铜的缺乏与过剩,铜与茶树抗逆性等问题进行了讨论。     

5种蔷薇科树种多酚氧化酶比较基因组学分析

蔷薇科植物中有多种具有重要价值的水果,如苹果、梨、桃、草莓和黑树莓等。这些水果普遍容易发生由多酚氧化酶(PPO)介导的酶促褐变而导致重大经济损失,从全基因组角度分析比较PPO基因家族,有助于加深对PPO基因家族和功能的认识。采用比较基因组学的方法,对这5种植物的PPO基因家族进行了基因鉴定、染色体定位、编码蛋白的亚细胞定位、内含子统计分析、基因系统进化、基因倍增与丢失等特征分析。从这5种植物中,共计鉴定出了42个PPO基因,其中6个基因被认定是假基因;绝大多数基因编码的蛋白定位于叶绿体,2个定位于线粒体,3个是分泌型蛋白;PPO基因在染色体上有串联重复和散布两种形式;9个基因具有内含子,聚类结果显示可以将它们分为6个类型,每个基因类型在进化过程中都发生过基因倍增和丢失;同型基因内含子的位置和大小具有相似性。这些结果揭示蔷薇科植物PPO基因内含子是伴随着基因倍增产生的,基因倍增也是推动PPO基因多样化的重要动力,PPO基因倍增和丢失差异导致PPO基因数量在不同物种之间产生差异。     

Characterization of polyphenol oxidase activity in a range of forage ecotypes with different phenol substrates. A new insight for PPO and protein‐bound phenol evaluation

Plant phenols can influence utilization of forages by ruminants through binding with proteins either by complexing with oxidized phenols (products of polyphenol oxidase activity or formed in oxidizing conditions) or by hydrogen binding with tannins. These protein‐bound phenols (PBPs) affect rumen metabolism by inhibition of both proteolysis and lipolysis. The aim of this work was to assess the level of polyphenol oxidase (PPO) activity (determined with a range of diphenolic substrates), PBP content, and to identify the main source of variation in different forage ecotypes harvested at different phenological stages. PPO activity was strongly influenced by substrate type with a significant effect of forage ecotype. Forage ecotype and phenological stage also influenced PPO and PBP content. PPO showed a strong relationship with dry matter and phenol content of plants.     

红茶制造中多酚氧化酶同工酶谱与活性的变化

本文运用聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳技术和酶活性测定相结合的方法,初步探明了红茶萎凋、揉捻、发酵和干燥工序中多酚氧化酶(PPO)活性及同工酶谱的变化动态,以及酶试液制备方法对PPO活性及同工酶的影响,发现造成萎凋期间PPO活性变化两种研究结果的原因,在于酶制液的制备方法不同。同时,在鲜叶和萎凋叶中发现了第7条小分子PPO组分。本试验还证明了红茶中残余酶活性的存在,并探讨了残余酶在贮藏中可能发生的作用。文中还探讨了PPO各组分在红茶制造中作用的大小,从酶学角度论证了萎凋工序的重要性。     

两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

为了选择合适载体,获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶,本研究以茶树叶片为材料,克隆茶树多酚氧化酶基因（CsPPO）,切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体,分别命名为pET32a-CsPPO₄₃、pET32a-CsPPO₇₀、pMALc5X-Cs PPO₄₃、pMALc5X-CsPPO₇₀,利用E. coil Transetta（DE3）菌株进行表达,经SDS-PAGE电泳检验,pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取,大量出现在上清液中;而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚、ECG、EC 3种底物在410βnm处检测CsPPO蛋白活性发现,pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显“S”型变化,表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。pMALc5X-CsPPO₄₃比活力比pMALc5X-CsPPO₇₀的高,其中pMALc5X-CsPPO₄₃与EC反应时酶比活力最高,最大比活力为1.45×10⁶β U·mg^-1。因此,可利用pMALc5X-CsPPO₄₃合成工业用PPO,为进一步研究其与儿茶素的反应机理,利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。     

小麦多酚氧化酶研究进展

综述了小麦多酚氧化酶(PPO)的测定方法、生理功能、酶学特性和基因及其表达。PPO主要位于小麦种(果)皮中,是一类铜结合酶,其活性中心为铜结合区(CuA和CuB),不同植物PPO的铜结合区的氨基酸序列同源性较高。PPO由核基因编码,受多基因控制,有多种同工酶。PPO是导致面制食品的酶促褐变的主要原因,与小麦的抗病性密切相关。