颗粒溶素在实验诊断中的应用

颗粒溶素是定位于NK细胞和CTL细胞胞浆颗粒中的细胞毒蛋白，其表达水平与NK细胞和T细胞活性有显著的一致性，是一种新的评估细胞免疫的标志物，可用于评估细胞免疫及其相关疾病。     

一例NK样T细胞淋巴瘤/白血病--附文献复习

目的提高对NK样T细胞淋巴瘤／白血病的认识？方法报道1例NK样T细胞淋巴瘤／白血病患者，并复习文献，总结该病临床及实验室检查特点。结果患者以发热、皮肤疱疹起病，肿瘤细胞主要分布于皮下小血管周围和血管腔内，免疫表型呈CD3（＋），CD8（＋），CD4（-），CD5（-），CDl0（-），CD19（-），CD57（-），CD56（＋），穿孔素（＋）和颗粒酶B（＋），T细胞受体1重排阳性。经糖皮质激素治疗一度好转，但很快复发，进展为NK样T细胞白血病，病程1年，死于多器官功能衰竭。结论NK样T细胞淋巴瘤／白血病非常少见，具有独特的临床、组织病理学和免疫表型特征，对现有治疗不敏感，预后恶劣。     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。     

NK/T细胞淋巴瘤的概念与病理诊断

NK／T细胞淋巴瘤是1997年WHO新的淋巴瘤分类中确立的一组特殊性外周T与NK细胞淋巴瘤。包括：①鼻、鼻型NK／T细胞淋巴瘤；②肠病型T细胞淋巴瘤；③皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤；④肝、脾γδT细胞淋巴瘤等。其起源于NK与细胞毒性T细胞（CTL）。具有特殊的临床表现、病理组织学、免疫表型及分子遗传学特点。已往概念不清，命名不统一，诊断标准不一致。本文重点将此类淋巴概念和病理诊断要点作一专题介绍。     

鼻NK／T淋巴瘤临床病理分析及免疫组化研究

鼻NK／T细胞淋巴瘤是一个独立临床病理亚型，其与EB病毒高度相关。肿瘤常有噬血管性，多伴有血管破坏和坏死。该瘤称为NK／T而不是NK细胞淋巴瘤，是大多数病例是NK细胞肿瘤，即EBV（＋），CD56（＋），少数病例具有EBV（＋）、CD56（-）的细胞毒性T细胞表型。发生在鼻部的肿瘤，表现鼻衄、鼻阻，皮肤和皮下组织是鼻NK／T细泡淋巴瘤常见的侵犯部位。作者收集50例鼻NK／T细胞淋巴瘤的临床病理资料，并进行病理形态学及免疫组化研究，为其诊断及鉴别诊断提供依据。     

九例脾脏T细胞和NK细胞淋巴瘤临床病理与免疫表型分析

目的探讨脾脏T细胞和NK细胞肿瘤的临床病理特征及病理诊断。方法复习9例脾脏T细胞和NK细胞肿瘤患者的临床病理资料并进行随访，进行免疫表型检测、EBER原位杂交及TCR-1基因重排检测。选用抗体有CD45RO、CD3ε、CD3、CD4、CD8、CD56、TIA-1、Granzyme B、CD30、Ki-67和CD20。结果本组9例患者中，4例为肝脾T细胞淋巴瘤，4例为结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤，1例为非特指外周T细胞淋巴瘤。7例有随访资料，5例死亡（2例肝脾T细胞淋巴瘤，2例结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤和1例非特指外周T细胞淋巴瘤），生存时间为1—10个月。2例存活，1例为结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤（2月余），1例为肝脾T细胞淋巴瘤（14月余）。结论脾脏T及NK细胞肿瘤是一组少见的具有不同临床病理特征的异质性淋巴瘤，均呈侵袭性临床过程，预后差。该类肿瘤的病理诊断须结合临床、形态学、免疫表型及基因重排检测进行。     

T细胞与移植物抗宿主病的关系

T细胞在移植物抗宿主病（GVHD）的发生发展中起关键作用。T细胞包括主要组织相容性抗原（MHC）限制性T细胞和非MHC限制性T细胞两种类型，前者指CD4^ T细胞和CD8^ T细胞，后者包括NK－T细胞和γδT细胞。CD4^ T细胞和CD8^ T细胞与GVHD密切相关，NK－T细胞和γδT细胞主要介导移植物抗白血病（GVL）效应。     

大颗粒淋巴细胞白血病

大颗粒淋巴细胞（LGL）白血病是一种少见的克隆性淋巴组织增殖性疾病。WHO分类将其区分为三种不同类型：T细胞大颗粒淋巴细胞白血病（T—LGL）,NK-细胞的慢性淋巴增殖性疾病（CLPD—NK）和侵袭性NK细胞白血病。虽细胞起源不同,但T—LGL与CLPD—NK在临床表现和治疗方面很相似,多数患者无症状不需要治疗,当出现明显的血细胞减少时,首先考虑免疫抑制治疗。相反,侵袭性NK细胞白血病和罕见的CD56＋侵袭性T—LGL白血病呈暴发性病程,发病年龄更早,需要较强的联合化疗序贯异基因造血干细胞移植。该类疾病相对稀少,故指导治疗的临床试验亦少。本文对该病的发病机制、诊断、治疗和预后进行了综述。     

自然杀伤性T细胞与移植

自然杀伤性T细胞（NKT细胞）是一种免疫调节细胞，同时表达T细胞及部分NK细胞标志。NKT细胞可在α—GalCer刺激下体外大量扩增，呈TH0样细胞因子分泌，激活后可以产生IL-4、IFN-γ等细胞因子，并具有细胞毒性作用。NKT细胞在诱导移植耐受、调节移植物抗宿主病及移植物抗肿瘤效应等方面具有一定作用，应用前景广泛。     

NK/T细胞淋巴瘤的病理组织学、免疫表型及基因研究

目的：筛选高效、方便、经济的对NK／T细胞淋巴瘤更进一步分类与诊断的检测方法。方法：收集了诊断为NK／T细胞淋巴瘤的34例患石腊包埋标本，27例发生于结外，7例发生在淋巴结。用多种抗体研究其免疫表型。EB病毒EBER探针原位杂交方法检测病毒感染。PCR方法检测T细胞受体β和γ基因的克隆性重排。结果：在34例结外淋巴瘤患中，18例CD56阳性，16例TIA-1阳性。2例皮肤淋巴瘤患中所有的瘤细胞Ki-67均阳性。在：EB病毒RNA检测中，12例发生于上呼吸消化道的病例阳性，包括鼻部的9例，以及鼻外的3例。同样在2例胃肠道淋巴瘤及1例皮肤淋巴瘤患中检测到EBER。22例上呼吸消化道淋巴瘤患中有2例检测到了TCRβ或γ基因克隆性重排，所有胃肠道和皮肤淋巴瘤患均检测到了TCR基因重排。2例其他部位结外淋巴瘤及7例结内淋巴瘤患中有5例显示TCR基因的克隆性重排。结论：大多数上呼吸消化道NK／T细胞淋巴瘤起源于NK细胞，只有一小部分为T细胞来源。然而，在皮肤及胃肠道中，NK样T细胞肿瘤更多见。在淋巴结中，NK细胞淋巴瘤很少。由于NK及NK样T细胞淋巴瘤的组织学改变相似，在进行NK细胞标志物、细胞毒性颗粒蛋白检测的同时必须检测TCR基因重排才会得到准确诊断。TCR的基因重排检测仍是鉴别NK和NK样T细胞淋巴瘤的重要标准。     

NKT细胞的研究进展

NKT细胞是一类具有NK细胞受体和T细胞受体且显示NK细胞和T细胞两方面性质的T细胞亚群。NKT细胞于1987年由Fowlker等首先在小鼠中发现，到20世纪90年代后期才在人类中发现，由于其表型和功能与传统T、B、NK细胞的不同，立即受到学者们高度重视。NKT细胞表达保守的限制性的TCR谱，其αβTCR结构单一。人NKT细胞由恒定的Vtr24 Jα18TCRα链和Vβ11TCRβ链组成，鼠NKT细胞由恒定的Vα14 Jα18TCRα链和多克隆的Vβ8.2、Vβ7和VB2TCRβ链组成。NKT细胞同时共表达NK细胞特有标志CD161（NK1．1抗原，鼠；NKR-P1抗原，人）。对NKT细胞的研究表明，简单把它理解成T淋巴细胞同时表达NK细胞受体是不准确的。许多传统的T淋巴细胞在活化后可上调NK细胞受体（包括CD161），而对于Vα24^＋NKT细胞则无这种表现。对人类淋巴细胞的研究发现，很大比例的T淋巴细胞都表达CD161，Vα24^＋Vβ11^＋细胞只是其中一个少数的亚群。     

NK细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

本研究探讨自然杀伤（NK）细胞在小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）中对移植排斥、造血及免疫重建的影响。以C57BL／6（H-2^b）小鼠为供鼠、BALB／c（H-2^d）小鼠为受鼠，分别在致死剂量和非致死剂量（≤7．0Gy）全身照射（TBI）的预处理条件下进行allo—BMT，移植同时输注供鼠外周T细胞和（或）NK细胞，移植后不同时间检测受鼠外周血白细胞、骨髓CD34^＋细胞数和外周血淋巴细胞中CD3^＋细胞、CD19^＋细胞及供鼠来源的H-2K^b＋细胞表达的百分率，并对不同移植组的存活率、植入与排斥、造血及免疫重建进行比较。结果表明：在致死剂量TBI预处理的移植中，输注NK细胞与不输注NK细胞的移植组比较，存活率显著增高（60天存活率为70％vs 0．0％）；白细胞数、CD19^＋细胞表达及骨髓CD34^＋细胞数恢复快；H-2K^b＋细胞的表达水平高[（86．68±4．45）％vs（4．68±0．32）％]。移植后28天输注NK细胞组CD3^＋细胞表达水平明显低于不输注NK细胞组[（33．69±3．36）％们（50．40±5．06）％，P〈0．01]，移植后60天两组比较差异无显著性（P〉0．05）。在非致死剂量TBI预处理的移植中，移植后30天．异基因骨髓移植组H-2K^b＋细胞表达率明显下降，移植后60天已下降至移植前水平；而输注高浓度和低浓度NK细胞的两组在移植后60天仍能检测到80％以上的H-2^b＋细胞表达。结论：在小鼠allo—BMT中，同种异基因反应性NK细胞可以抑制移植排斥，提高造血干细胞的植入水平，促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率。     

CYR61和血管内皮生长因子在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及其意义

目的 研究血管诱导生成因子61（CYR61）和血管内皮生长因子（VEGF）在结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中的表达及其意义。方法 应用实时荧光定量PCR和免疫组化技术分别检测结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中CYR61 mRNA、VEGF mRNA及其蛋白水平表达。结果 ①经实时荧光定量PCR检测，20例中有19例（95．0％）CYR61 mRNA表达上调，15例（75．0％）VEGF mRNA表达上调。②经免疫组织化学染色，40例中有38例（95．0％）肿瘤细胞CYR61蛋白阳性，25例（62．5％）VEGF蛋白阳性，与对照组比较差异均无统计学意义；CYR61和VEGF在mRNA和蛋白水平表达的一致率分别为95．0％和65．0％；8例患者CYR61 mRNA、VEGF mRNA及其蛋白表达一致。③通过生存分析显示CYR61 mRNA和VEGF mRNA表达上调者预后较差，CYR61和VEGF表达水平与结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤的预后相关。结论 CYR61和VEGF在结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中的表达水平有变化，并与该肿瘤的预后可能有一定的关系。     

体外不去T细胞单倍体造血干细胞移植后NK细胞免疫球蛋白样受体重建的影响因素

目的探讨造血干细胞移植（HSCT）后早期NK细胞免疫球蛋白样受体（KIR）恢复的影响因素。方法借助三色和四色荧光标记技术，用流式细胞术对24例行体外不去T细胞的HLA不相合HSCT的患者（移植前、＋30天、＋60天）及其供者外周血中NK细胞KIR的表达进行了测定，包括CD158a（KIR2DL1）、CD158b（KIR2DL2）和CD158e（KIR3DL1）；同时用流式细胞术对移植物中CD3、CD4、CD8、CD14、CD34的含量进行了测定。结果发生Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病（aGVHD）患者在＋30天NK细胞KIR的表达明显低于0～I度aGVHD患者，CD158b[分别为（19．27±9．40）％和（28．92±10．59）％，P=0．018]和CD158aCD158b[分别为（7．30±4．73）％和（14．26±9．71）％，P=0．016]尤为显著。多因素分析表明移植物中CD4^＋T细胞是引起aGVHD的危险因素。进一步的相关分析表明每千克体重输入的CD4^＋T细胞数与移植后早期NK细胞上CD158a、CD158aCD158b和CD158e的表达呈明显的负相关。结论体外不去T细胞的HLA不相合的HSCT中，不仅移植后aGVHD的发生或其相应的治疗措施抑制了移植后早期NK细胞上KIR的恢复；而且移植物中T细胞也直接或间接影响了移植后早期NK细胞上KIR的重建，进而影响了NK细胞功能的恢复。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪（FAcs）技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆化，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5：1、10：1、20：1、40：1的比例混合，分别孵育0．5、1、2、4h后用碘化丙啶（PI）标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0．5、1、2、4h均能得到明显的杀伤效果，而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法（LDH）具有显著相关性（7=0．997，P=0．003），而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统^51Cr释放法、LDH法的一个补充，而且具有经济、快速和敏感的特点。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素（GNLY）质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2（IL-2）刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,得到重组质粒pET28a（＋）-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍（Ni）亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot）进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a（＋）-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞活性的研究打下了基础。     

穿孔素的研究进展

穿孔素（perforin，又称成孔蛋白，poreforming protein，PFP）是一种存在于细胞毒性T细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）胞浆的细胞毒颗粒巾的精蛋白。近年来，有关PFP的研究日益活跃，对PFP蛋白质结构、表达与调节机制、PFP介导的细胞毒效应在抗感染免疫中的作用以及PFP的免疫调节作用进行了广泛深入的研究，本文就这些方面的研究进展作一综述。     

急性白血病患者非血缘脐血干细胞移植后NK细胞及其表面受体的早期重建

本研究探讨非血缘脐血移植（unrelated cord blood stem cell transplantation,UCBT）后早期NK细胞及其表面受体重建的特点和规律及其对临床的重要性。对11例接受UCBT的急性白血病患者使用流式细胞术分别检测UCBT后受者早期（植活后90天内）NK细胞及其表面受体的重建以及T细胞和B细胞的免疫重建情况。结果表明：UCBT后NK细胞重建较早,植活时外周血中NK细胞数即高于正常水平;植活后30天达峰值,60天时绝对值达峰值水平。NK表面活化性受体NKG2D的重建早,植活时即高表达,并逐步上升,约60天达峰值（82．55±9．10）％;NK细胞的另一种活化性受体NKp46也获得早期重建,至植活后90天仍维持在高水平。NK细胞抑制性受体NKG2A在UCBT后表达较活化性受体低并持续至移植后90天。UCBT后T细胞的重建较晚,表达水平低。结论：急性白血病患者UCBT后早期NK细胞的重建较早;NK细胞表面活化性受体特别是NKG2D的重建早于抑制性受体,提示NK细胞的活化可能在UCBT后早期移植物抗白血病（GVL）作用中承担了重要角色。     

鼻腔NK/T细胞淋巴瘤细胞毒蛋白的表达及意义

目的探讨细胞毒蛋白TIA1和GranzymeB在鼻NK／T细胞淋巴瘤(NK／T)的表达及意义。方法以NK／T淋巴瘤35例石蜡组织标本为研究对象，同部位B细胞淋巴瘤10例和淋巴结外周T细胞淋巴瘤5例为对照。行En—vision免疫组化染色。结果。35例NK／T中CD45RO阳性32例，CD3ε30例，CD5616例，TIA129例、GranymeB21例、CD3010例、CD117全部阴性。10例面部B细胞淋巴瘤上述抗体染色均阴性。淋巴结外周T细胞淋巴瘤5例均TIA1( )，3例CD3ε( )，1例GranzymeB( )。背景反应性中性粒细胞和组织细胞常表达TIA1，但不表达GranzymeB；肿瘤细胞异型性和CD30,／Granzyme B表达显著相关。结论TIA1和GranzymeB对NK／T的标记有很好的敏感性和特异性，GranzymeB的特异性大于TIA1；NK／T的常规诊断可在形态学的基础上，联合使用CD45RO、CD3、CD56、细胞毒蛋白免疫组化染色确定；GranzymeB表达与肿瘤细胞的异型性和CD30表达密切相关，其意义尚待深入探讨。     

NK细胞免疫治疗恶性肿瘤的研究进展

细胞免疫治疗是针对自身免疫细胞能力低下的恶性肿瘤患者进行的一种新型补充疗法,包括基于T细胞的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）疗法,基于NK细胞的嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）疗法和自体细胞免疫疗法（CIK）,还有基于其他免疫细胞如单核吞噬细胞,包括树突状细胞和巨噬细胞的输注治疗。其中,自然杀伤细胞（nature killer cell,NK细胞）作为机体天然免疫的重要细胞,在机体抗肿瘤、抗病毒感染、免疫调节中发挥着重要作用。它可以像T细胞一样通过工程化改造后靶向治疗肿瘤,还能够进行同种异体来源的NK细胞输注治疗,弥补了T细胞自体来源受限和异体免疫排斥的缺点。研究证实,输注异体NK细胞的患者不会发生严重的移植物抗宿主病（graft versus hostdisease,GVHD）。N K细胞不仅扩大了用于细胞免疫治疗的细胞种类,还为形成较低成本的细胞免疫治疗产品提供了广阔应用前景。但是目前仍存在NK细胞质量不稳定,制备流程缺乏统一质量标准等问题,虽有部分NK细胞免疫治疗产品已经获得了美国食品药品监督管理局（Food and Drug Adminis...