抗人跨膜型肿瘤坏死因子-α多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异的能区分人跨膜型肿瘤坏死因子（TM—TNF—α）和分泌型肿瘤坏死因子（sTNF—α）的多克隆抗体。方法借助抗原肽预测软件对TM—TNF—α的抗原表位进行预测，合成TM—TNF—α特异的20个氨基酸的多肽，将之与匙孔碱血蓝蛋白（KLH）耦联。BALB／c小鼠皮背部多点注射，收集分离血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术鉴定其特异性。结果成功免疫BALB／c小鼠，ELISA证实该抗血清与免疫多肽有良好的结合，而与sTNF-α、白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）无交叉反应，流式细胞术显示该抗血清可与细胞系U937表达的TM—TNF—α发生特异性结合。结论成功制备了TM—TNF—α特异性多克隆抗体。为制备TM—TNF—α特异性单克隆抗体莫定了基础，为区分TM—TNF—α和sTNF—α的生物学作用提供了有力的工具。     

INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备

目的INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备。方法利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白。用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体。结果成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,Westernblot检测结果显示,该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHA表达系统,获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。     

制备多克隆抗体所用动物的选择

制备多克隆抗体所用动物的选择陈筱侠摘编（上海实验动物研究中心，上海２０００３２）利用实验动物制备抗体，是某些医学实验中的一个重要部分。制备抗体成败的关键在于选择合适的制备方法和动物种类，本文介绍有关这方面的资料。１．动物种类的选择选择制备多克隆抗体（...     

沙丁胺醇多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

目的:制备特异性好的沙丁胺醇多克隆抗体,优化并建立间接ELISA快速检测沙丁胺醇(SAL)浓度的方法。方法:采用小剂量长周期的方式免疫新西兰大白兔,优化ELISA检测方法,检测一系列SAL浓度,建立标准曲线,并对方法的精密度和回收率进行测定。结果:所制备的沙丁胺醇多克隆抗体的IC50为12.21 ng/ml,建立了间接ELISA检测SAL浓度的标准曲线,样本的回收率在95%～105%之间,变异系数﹤3%。结论:本研究建立了快速、灵敏的间接ELISA检测SAL浓度的方法。     

递呈BAE5单抗相关表位的M13噬菌体克隆系及其鉴定

[目的]获得可递呈BAE5单克隆抗体抗原表位的M13噬菌体克隆系.[方法]应用生物淘洗(Biopanning)方法,从M13噬菌体随机12肽文库中筛选出能与BAE5单克隆抗体有阳性反应的噬菌体克隆系.通达ELISA竞争反应确定与BAE5单抗结合率较高的克隆,鉴定这些阳性克隆与正常鼠血清,鼠抗M13血清和健康人IgG,IgA抗体的反应差异.[结果]经过3轮淘洗,与BAE5单克隆抗体有阳性反应的克隆占83%(15/18).其中竞争结合率>50%克隆有1、2、7、9、13、14号6个克隆,它们与BAE5单抗的竞争结合率分别为56.3%、59.5%、58.0%、62.8%、56.4%、63.4%.其中只有1、9、14.号克隆的噬菌体与正常小鼠血清不显示交叉反应.[结论]来自1、9、14.号克隆的噬菌体递呈的抗原表位有别于其它克隆,适用于BAE5单抗相关表位的研究.     

二种酶标记免疫技术检测抗精子抗体的比较

目的：用金标免疫斑点试验与酶联免疫吸附试验检测血清、宫颈粘液中抗精子抗体的比较。方法：199例男性不育患者的血清，139例女性不孕患者的宫颈粘液用2种不同检测方法后结果比较。结论：金标免疫斑点试验特异，敏感、简便、快速更具推广价值。     

小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.     

互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品

目的:纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品.方法:利用人精子抗原及其他组织蛋白等分别制备亲和层析柱,经正反相互补式亲和层析从兔抗血清中纯化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗体,用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等法检测其纯度、特异性和与精子抗原的线性反应.结果:所得抗体与牛血清白蛋白、正常人全血清、正常人组织细胞裂解液等在诊断试剂中常有的物质无可见交叉反应,在7.8120～0.488 2ng·ml-1或31.250～1.953ng·ml-1浓度范围内与精子抗原的酶联吸附试验呈直线反应.结论:该纯化方案可用于抗精子抗体定量检测中抗体标准品的制备.     

多西环素多克隆抗体的制备及鉴定

目的:采用人工偶联方法构建多西环素完全抗原,制备多克隆抗体。方法:分别采用直接偶联法、甲醛一步法、重氮法+混合酸酐法和重氮法+碳二亚胺法等4种方法将多西环素与牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)或鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联,构建人工完全抗原。选择最好偶联效果制备的抗原免疫BALB/c小鼠,通过直接ELISA法检测多克隆抗体效价,竞争抑制ELISA法分析其灵敏性及特异性。结果:重氮法+碳二亚胺法偶联的多西环素人工完全抗原效果最好,其与BSA的偶联比为8.37∶1,与OVA的偶联比为4.92∶1。采用该方法偶联的抗原免疫小鼠获得的多克隆抗体效价在1∶8 000以上;该抗体对多西环素的半数抑制浓度(IC50)为98.89~120.32μg/L,与其他四环素类药物的交叉反应性较低。结论:重氮法+碳二亚胺法的偶联效率最高,获得的多西环素多克隆抗体效价较高,特异性和灵敏度均较理想。     

Preparation and Characterization of Polyclonal Antibodies against VLDL Receptor

Verylowdensitylipoproteinreceptor (VLDL R)belongstothelowdensitylipoproteinreceptor(LDL R)superfamily .ItmaybindsthelipoproteinsandlipoproteinlipasescontainingapoE ,participatinginthemetabolismoftriglyceride richlipoproteins,whichplayanimportantroleinpath…     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位

目的制备一系列Argonaute（简称AGO）蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果通过构建系列AGO多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备了3个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Westernblot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在部分肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA／RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

人肝脏微粒体多克隆抗体的制备

目的 利用肝脏微粒体制备多克隆抗体,为制备肝微粒体单克隆抗体奠定基础。方法 用肝微粒体制备抗原,免疫动物制备抗体,并用免疫沉淀、固相免疫吸附、Westem blotting法鉴定抗体特性。结果 在动物血清中检测到多克隆抗体。结论 鉴定肝微粒体多克隆抗体为将来制备肝微粒体单克隆抗体做前期工作。     

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testis like 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布.方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体.亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究. 结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体.ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽.人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色. 结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础.     

人肝脏微粒体蛋白凝胶免疫多克隆抗体的制备

目的制备人肝微粒体蛋白多克隆抗体,为进一步研究微粒体蛋白的功能及制备单克隆抗体打下基础.方法用含人肝微粒体高丰度蛋白的蛋白凝胶免疫家兔,再用ELISA和Western blot方法检测血清效价和抗体特异性.结果 2只家兔均产生了高效价的抗血清,Western blot结果显示,抗血清可以与相应蛋白结合.结论用含人肝微粒体高丰度蛋白的蛋白凝胶免疫的2只家兔均获得了高效价的抗血清,为深入研究该蛋白的定性、定量及定位奠定了基础,并为将来进行单克隆抗体的制备做前期技术支持.     

人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定

目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定。方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮“吸附洗脱扩增”的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价。结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力最强者产生抗体活性为106。结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157:H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86(0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157:H7EspF蛋白的抗血清效价达1:2048000;该血清对EHECO157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157:H7EspF蛋白多克隆抗体。     

抗人脑源性神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗人脑源性神经营养因子(BDNF)单克隆抗体。方法利用BDNF纯品与酸处理后的沙门氏菌菌体(抗原∶菌体为1∶5)混合免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。结果获得3株抗BDNF的单克隆抗体,分别命名为B1、B2和4D1,mAb的Ig亚类均为IgG1。ELISA间接法测定腹水mAb效价为1×10-6~1×10-5,各单抗相对亲和力结果为B2>B1>4D1。结论成功研制出抗人BDNF单克隆抗体,为进一步研究BDNF在体内组织的表达及分布提供了一种工具,并为基因工程制备BDNF提供了检测方法。     

一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白多克隆抗体制备

目的 获得一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白(IRF-4-binding protein,IBP)的高效价特异性多克隆抗体.方法 通过生物信息学分析选择IBP特异片段(1228～1893 bp),目的 片段cDNA插入pET32a和pGEX-KG原核表达载体,分别转化B1221感受态细菌,IPTG诱导表达后组合应用阴离子交换层析、His、GST亲和层析技术获得免疫原(pET32a/IBP融合蛋白)及检测原(pGEX-KG/IBP融合蛋白).HPLC鉴定纯度.利用改良快速免疫法获得兔抗IBP多克隆抗血清,井经蛋白A柱纯化,非特异性扰体吸收.间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化实验检测抗体特异性.结果 表达并纯化的pET32a/IBP融合蛋白纯度达92%,pGEX-KG/IBP融合蛋门纯度达87%.IBP多克隆抗体滴度达1:51 200,能特异地和内源性IBP结合.结论 成功表达并纯化了 IBP融合蛋白,制备了高滴度、高特异性的抗IBP多克隆抗体.