原发性肝癌RUNX3基因启动子区甲基化及mRNA表达及其意义

目的 观察原发性肝癌中人RUNT相关转录因子3(RUNX3)基因启动子甲基化及mRNA表达,探讨其甲基化与临床特征的关系.方法 收集75例原发性肝癌患者的肿瘤标本及其癌旁组织、10例正常肝组织,应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)测定RUNX3基因CpG岛甲基化状态,并采用实时定量聚合酶链反应(PCR)分析RUNX3基因在75例原发性肝癌中的表达水平及甲基化与肝癌临床特征的关系.结果 75例肝癌组织中有34例(45.3％)存在RUNX3基因CpG 岛的异常甲基化,癌旁组织中有7例(9.3％),而正常肝组织中未检测到RUNX3基因CpG岛的异常甲基化,RUNX3基因异常甲基化在肝癌组织、癌旁组织及正常组织中的发生率差异有统计学意义(x2=29.18,P＜0.01);75例原发性肝癌实时定量PCR分析有45例肝癌组织中存在RUNX3 mRNA 表达缺失或下调,其中60％ (27/45)伴随启动子甲基化,即RUNX3 mRNA表达下调与RUNX3基因甲基化密切相关(x2=9.77,P＜0.01);而肝癌组织非甲基化组RUNX3基因表达量高于甲基化组4倍以上;RUNX3基因CpG岛甲基化与患者肝硬化关系密切(x2=5.07,P＜0.05).结论 原发性肝癌存在RUNX3基因CpG岛异常甲基化,CpG岛的甲基化可能是导致其基因表达降低的主要原因之一,并与患者肝硬化密切相关.     

原发性肝癌RASSF1A基因启动子区甲基化及其临床意义

目的 探讨原发性肝癌中RASSF1A基因启动子的甲基化水平及其与临床病理特征的关系.方法 采用MSP测定100例原发性肝癌患者的肿瘤标本及其癌旁组织、6株肝癌细胞株及10例正常肝组织RASSF1A基因甲基化状态,分析甲基化与肝癌临床病理特征的关系.采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理肝癌细胞株,用RT-PCR检测RASSF1A的重新表达情况.结果 100例肝癌组织中有69例(69％)存在RASSF1A基因CpG岛的异常甲基化,癌旁组织中有15例(15％),6株肝癌细胞株有4株(4/6)发生甲基化,而正常肝组织中无RASSF1A基因甲基化存在,RASSF1A基因异常甲基化在3种组织中的发生率差异有统计学意义(x2=67.75,P＜0.001).RASSF1A基因启动子甲基化与患者乙肝表面抗原及组织分化存在一定相关性.发生甲基化的4株肝癌细胞株经甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理后,全部重新恢复表达.结论 原发性肝癌存在RASSF1A基因CpG岛异常甲基化,并与患者乙肝表面抗原及组织分化密切相关.经甲基化抑制剂处理的肝癌细胞株又重新恢复表达,推测CpG岛的甲基化可能是导致其基因表达降低的主要原因之一.     

TSA对人肝癌细胞株E-cadherin启动子区甲基化及表达的影响

目的 探讨去乙酰化转移酶抑制剂TSA对人肝癌SMMC-7721细胞株E-cadherin基因(E-cad)启动子区甲基化及其表达的影响.方法 TSA(300 nm/L)处理人肝癌SMMC-7721细胞,MTT法、TUNEL染色法分别检测细胞生长抑制及凋亡情况,甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MSP)检测处理前后E-cad启动子区CpG岛甲基化状态;Western blot检测处理前后E-cad及DNMT3b表达水平的变化.结果 TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长并诱导其发生凋亡,与对照组相比,实验组细胞生长抑制率为21.85%,对照组细胞凋亡率为(4.69±0.56)%,实验组凋亡率为(14.94±0.91)%,与对照组相比,凋亡细胞明显增多(P=0.000).用药前E-cad启动子区CpG岛为甲基化状态,E-cad蛋白表达阴性.TSA处理后E-cad启动子区CpG岛发牛脱甲基化,E-cad蛋白恢复表达.TSA亦导致DNMT3b的表达水平降低. 结论去乙酰化转移酶抑制剂TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长,并可诱导其发生凋亡,逆转E-cad基因启动子区的甲基化状态,并恢复该基因表达.TSA有可能通过DNMT3b发挥脱甲基化作用.     

沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16|RASSF1A基因启动子甲基化的影响

目的:探讨沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16,RASSF1A基因启动子甲基化的影响。方法:将胰腺癌BxPC-3细胞分为5组:DNMT1干扰组(转染DNMT1-siRNA),DNMT3b干扰组(转染DNMT3b-siRNA),双重干扰组(转染DNMT1+DNMT3b-siRNA),阴性对照组(转染阴性siRNA)和空白对照组(转染脂质体)。转染48 h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1和DNMT3b的mRNA及蛋白的表达水平;甲基化特异性PCR法检测p16和RASSF1A基因启动子甲基化。结果:与空白对照组和阴性对照组比较,各干扰组目的基因的mRNA及蛋白表达量均明显降低(均P<0.01)。空白对照组与阴性对照组p16和RASSF1A基因甲基化阳性;DNMT1干扰组和双重干扰组p16基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化;DNMT3b干扰组p16基因部分甲基化,RASSF1A基因甲基化阳性。结论:DNMT1单干扰对胰腺癌BxPC-3细胞p16和RASSF1A基因的去甲基化作用优于DNMT3b单干扰,DNMT1和DNMT3b双重干扰无明显的协同效应;提示DNMT1是胰腺癌去甲基化治疗的一个有效靶点。     

启动子区甲基化对miRNA-122表达及肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨DNA甲基化对肝特异性miRNA-122表达调控以及肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 甲基化测序检测肝细胞中miRNA-122启动子区的甲基化状态.实时定量PCR检测肝细胞中miRNA 122表达水平.流式细胞仪与CCK8检测去甲基化对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.结果 与人原代正常肝细胞[(21.9±11.4)％]比较,Huh7、HepG2、QSG-7701细胞系miRNA-122启动子区的甲基化程度[分别为(87.6±9.3)％、(89.0±14.3)％、(69.5±11.5)％],均明显升高(P=0.000),尤其以Huh7、HepG2两种癌细胞系升高最为明显.与人原代正常肝细胞[(2.83×104±3746)]比较,三种细胞系miRNA-122的表达明显下降,其中以Huh7和HepG2两种癌细胞系降低最明显(P=0.007).与空白对照比较,在10 μmol/L的5氮杂-2′-脱氧胞苷作用下,Huh7和HepG2两种癌细胞系甲基化程度明显降低(P=0.038,0.025);而其miRNA-122表达明显升高(P=0.008,0.003).与空白对照组比较,Huh7细胞与HepG2细胞经去甲基化处理后细胞的凋亡均明显增加(P=0.001,0.027).结论 肝特异性miRNA-122的表达受DNA甲基化的明显调控,且与肝癌细胞的凋亡密切相关.miRNA122的甲基化调控可能参与了肝癌的发生和发展.     

DNA甲基转移酶3b对肝癌细胞株中STAT1及其下游基因c-myc的表达和启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)在人肝癌细胞株(SMMC7721)中对STAT1和c-myc基因表达及其启动子甲基化水平的影响,并进一步探讨DNMT3b的作用.方法 用DNMT3bsiRNA抑制DNMT3b在SMMC7721细胞系中的表达,用Western blot技术检测其转染前后DNMT3b及STAT1和c-myc基因的表达.应用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测两组细胞中STAT1和c-myc基因启动子区的甲基化状况.结果 转染DNMT3bsiRNA的实验组DNMT3b表达水平明显低于对照组,STAT1基因的表达高于对照组;c-myc基因的表达低于对照组.两组中STAT1和c-myc基因启动子区甲基化状态无差异,均未发生甲基化.结论 DNM33b可以调节STAT1和c-myc基因的表达,而不改变基因的甲基化状态,可能发挥了转录调控因子的作用.     

肝细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达的研究

目的 探讨细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录-聚合酶链反应技术,检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中WIF-1基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析上述组织WIF-1基因甲基化及mRN表达与临床资料的关系并分析甲基化对mRNA表达的影响。结果 WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织（Х^2=4．89,P〈0．05）,而癌旁组织和正常组织中WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中WIF-1基因甲基化与乙肝表面抗原、肝硬化有关;WIF-1基因mRNA表达量在三种组织中比较无明显差异。结论 WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;WIF-1基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系有待进一步研究。     

肝癌细胞NFAT2基因启动子区甲基化与其mRNA表达的关系

目的:探讨肝癌细胞中NFAT2基因启动子CpG岛甲基化状态及与其mRNA表达的关系。方法:用重硫酸盐测序法检测肝癌组织与癌旁组织及不同肝细胞系与正常肝细胞中NFAT2启动子甲基化状态,用qRT-PCR检测肝癌组织与癌旁组织NFAT2 mRNA表达,并分析肝癌组织NFAT2启动子甲基化与mRNA水平的相关性。结果:肝癌组织中NFAT2基因CpG岛甲基化率明显高于癌旁组织(33.0%vs.21.6%,P=0.003);人肝癌细胞系HuH7、HepG2、Hep3B中NFAT2基因CpG岛甲基化率分别为34.8%、40.4%、37.0%,均明显高于人正常肝细胞系L02中NFAT2基因CpG岛甲基化率(16.2%)(均P0.05)。肝癌组织NFAT2 mRNA相对表达量明显低于与癌旁组织(0.000 602 4 vs.0.001 469,P0.05),肝癌组织中NFAT2 mRNA水平与其启动子甲基化程度呈明显负相关(r=-0.661,P=0.027)。结论:肝癌细胞中NFAT2基因表达下调可能与其启动子区CpG岛高甲基化状态有关     

肝细胞癌中HBX和MATs基因启动子甲基化的关系

目的 观察肝细胞癌(HCC)中乙肝病毒X蛋白(HBx)、甲硫氨酸腺苷转移酶1A(MAT1A)和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的表达以及HBx对MAT1A、MAT2A基因启动子的甲基化状态的影响,探讨HCC中MATs发生转化的机制.方法 应用免疫组织化学法检测78例乙型肝炎病毒(HBV)阳性HCC组织中HBx、MAT1A、MAT2A的表达,并用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)法检测上述组织中MAT1A、MAT2A的甲基化状态,并将上述检测结果进行相关分析.结果 免疫组织化学结果表明,在78例HCC组织中,HBx、MAT1A、MAT2A阳性表达分别为59例(75.64%)、17例(21.79%)和66例(84.62%);HBx表达和MAT1A表达为负相关(P＜0.05),和MAT2A表达为正相关(P＜0.05),MAT1A和MAT2A表达为负相关(P＜0.05);MS-PCR结果表明,78例HCC组织中,MAT1A甲基化占58例(74.36%),MAT2A甲基化为9例(11.54%),HBx表达和MAT1A启动子甲基化状态呈正相关(P＜0.01),和MAT2A启动子甲基化状态呈负相关(P＜0.01).结论 HBx同MAT1A、MAT2A的表达明确相关,它能通过某些途径引起MAT1A启动子高甲基化、MAT2A启动子低甲基化来改变MATs的表达状态.

Abstract：

Objective To investigate the effect of hepatitis B virus x-protein (HBx) on the expression of MATs, the methylation status of methionine adenosyltransferases (MATs) ' promoters in hepatocellular carcinoma ( HCC), and the possible mechanism of MATs' change in HCC. Methods The expression of HBx, MAT1 A and MAT2A was detected in 78 HBV-positive HCC samples by IHC method and their correlation was analyzed. The methylation status of the promoters of MAT1A and MAT2A was examined. Results In 78 HCC tumor specimens, the positive expression rate of HBx, MAT1A and MAT2A was 75.64% (59 cases), 21.79% ( 17 cases) and 84. 62% (66 cases). There was a negative correlation between the expression of HBx and MAT1A (P ＜0. 05), a positive correlation between HBx and MAT2A ( P ＜ 0. 05), a negative correlation between MAT1A and MAT2A ( P ＜ 0. 05 ). MS-PCR revealed that there were 58 cases of MAT1A promoter' hypomethylation (74. 36% ), 9 cases of MAT2A promoter' hypomethylation ( 11.54% ). The positive expression of HBx was positively related with promoter' hypomethylation of MAT1A (P ＜ 0. 01 ), but negatively with promoter' hypomethylation of MAT2A ( P ＜ 0. 01 ).Conclusion The expression of HBx has relationship to the expression MAT1A and MAT2A in HCC tumor tissues, which is contributed to the fact that HBx can change the methylation status of MATs' promoters by some unknown pathways.     

肝细胞癌GSTP1基因启动子区甲基化的研究

基因启动子区异常甲基化抑制转录是基因失活的又一机制，也是人类肿瘤发生的重要机制之一。肝细胞癌（HCC）发生的分子机制仍不十分清楚。我们采用甲基化特异性PCR（MSP法）检测了HCC中GSTP1基因启动子甲基化，探讨其在HCC发生中作用。     

5-aza-CdR对肝癌SMMC7721细胞株PDCD4基因甲基化及表达的影响

目的 研究5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)在肝癌细胞株SMMC7721中对程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达的影响及可能机制.方法 培养肝癌细胞株SMMC7721,用5-aza-CdR处理肝癌细胞株SMMC7721,Western-blotting检测DNMT3b、PDCD4蛋白在处理前后的变化,甲基化特异性PCR即MSP检测PDCD4基因启动子区域甲基化水平.结果 1×10~(-6)mol/L、5×10~(-6)mol/L的5-aza-CdR作用于SMMC7721细胞后,DNMT3b表达水平降低,而PDCD4表达水平升高,且浓度之间有差异;MSP示药物处理前PDCD4启动子区域处于高甲基化水平,在用5×10~(-6)mol/L药物处理后,其启动子发生了去甲基化.结论 5-aza-CdR可以抑制DNMT3b在SMMC7721中的表达,且可能通过改变抑癌基因PDCD4启动子甲基化状态影响PDCD4表达.     

重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响

目的 观察重组人DNMT1真核表达质粒转染对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA表达水平和细胞生长曲线的影响。方法 将构建好的正义和反义DNMT1真核表达质粒用脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-939,然后用G418进行筛选,得到阳性克隆细胞株后,用半定量RT-PCR检测DNMT1基因的mRNA水平的变化,用MIT法观察细胞生长曲线。结果 正义DNMT1真核表达质粒能使QBC-939细胞中的DNMT1基因的mRNA水平增加,而反义DNMT1真核表达质粒则使其mRNA水平降低;正义质粒可使QBC-939细胞增殖速度加快,反义质粒使其增殖速度减慢。结论 重组人DNMT1真核表达质粒转染能影响胆管癌细胞DNMT1基因的mRNA表达水平和细胞生长曲线。     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

膀胱尿路上皮癌中DNMT1的表达及其临床意义

目的研究DNA甲基转移酶1（DNMT1）在膀胱尿路上皮癌（BUC）中的表达,探讨DNMT1与膀胱癌生物学行为之间的关系。方法采用RT—PCR法和Western-blot技术,检测60例膀胱尿路上皮癌及12例正常膀胱黏膜组织中DNMT1的表达;并结合临床资料进行分析。结果①膀胱癌组织中DNMT1蛋白和mRNA的表达水平分别为0．628±0．245和0．774±0．083,显著高于正常膀胱黏膜组织的0．126±0．028和0．175±0．101（P=0．000）;②DNMT1在膀胱癌中的表达水平与肿瘤的临床分期、分化程度、有无淋巴结转移等生物学行为显著相关。结论DNMT1在膀胱尿路上皮癌中过度表达,在膀胱癌的发生发展中起重要作用。     

DNA甲基转移酶1、3b基因共下调对人胆管癌细胞生长的抑制效应

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞QBC-939生长的影响。初步探讨DNMT1、DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将两者联合转入人胆管癌细胞QBC-939,Western blot检测转染前后相应蛋白的表达变化,噻唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化,裸鼠皮下种植细胞观察成瘤大小。结果(1)Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低；(2)联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,其中以前者为甚；(3)联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G_1期,使细胞凋亡率从(1．63±0．27)%分别增加到(18．47±1．46)%和(6．19±0．78)％；(4)联合转染反义DNMTl、DNMT3b基因和单独转染反义DNMTl能使裸鼠皮下种植成瘤体积减小。生长延缓,前者效果更为明显；(5)在上述效应检测中,联合转染空质粒和单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论(1)通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,可同时下调DNMT1和DNMT3b在QBC-939细胞中的表达,并能在体内外抑制胆管癌细胞的生长,促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DN—MT1反义基因。(2)在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,两者可能通过甲基化途径与胆管癌的发生有关。     

反义DNMT3b基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞DNMT3b基因表达的影响

目的观察反义DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因表达的影响。方法构建反义DNMT3b基因真核表达载体,通过脂质体转染到人胆管癌细胞株QBC939中,G418筛选得到稳定转染细胞株,PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染是否成功。半定量RTPCR观察转染前后DNMT3b基因mRNA水平的变化,流式细胞术检测转染前后DNMT3b蛋白的变化。结果反义DNMT3b基因真核表达载体转染能使人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因的mRNA水平从0.956±0.053降低至0.209±0.023,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术检测结果显示,DNMT3b蛋白水平从(75.38±3.22)%降低到(29.87±3.46)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论反义DNMT3b基因转染能降低人胆管癌QBC939细胞中DNMT3b基因的表达水平,为研究DNMT3b基因功能及其在胆管癌细胞中的作用提供了方法和实验依据。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.