水杨酸和茉莉酸甲酯对高温龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)理化及基因表达的影响

本文研究了两种抗逆植物激素——水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)对高温胁迫龙须菜的生长、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、碳酸酐酶(CA)、硝酸还原酶(NR)活性及4种相关基因表达的影响。结果表明,100μmol/L SA(SA100)、50μmol/L MJ(MJ50)、50μmol/L SA+25μmol/L MJ(SA50/MJ25)实验组对龙须菜生长促进作用较大,其相对生长速率分别为对照组的1.78、1.65和1.29倍。这3个处理组均可提高龙须菜脯氨酸含量,其中SA100作用最强;对MDA含量的降低程度以SA50/MJ25组最强。SA100增强SOD和CA活性的作用最大,而MJ50可增强NR活性。SA100处理HSP70、Mn SOD、CA和NR基因表达量分别为对照组的2.04、4.65、2.15和1.58倍,MJ50处理后Mn SOD、CA和NR基因表达量则分别降为对照组的0.47、0.50和0.46倍,而SA50/MJ25则促进了HSP70基因表达,降低了CA和NR基因表达。本研究表明SA和MJ可以缓解高温胁迫对龙须菜的不利影响,其中以SA100的作用最大,MJ50作用最小。     

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)对逆境胁迫的响应

非还原性二糖海藻糖及其代谢物是调控植物生长发育和逆境响应的信号分子。本研究以大型海藻龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)为对象,从基因转录、蛋白和酶活性3个水平探讨了海藻糖合成酶——海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)对高温、高盐及渗透胁迫的响应。龙须菜中4条TPS序列均具有TPS家族保守结构域(Glyco-transf-20)和TPP家族保守结构域(Trehalose-PPase),且属于Class I亚家族。在转录水平上,高盐胁迫主要促进了TPS1、TPS2和TPS4基因的表达,而渗透胁迫则总体抑制了TPS1、TPS2和TPS3基因的表达。在高盐胁迫48 h时, TPS1蛋白含量升高到对照组的2.03倍。在高温和高盐胁迫24 h时, TPS活性升高,而在高盐胁迫48 h及渗透胁迫条件下酶活性降低。可见海藻糖-6-磷酸合成酶参与了龙须菜抗高温和高盐胁迫的应答,但对渗透胁迫不敏感。该研究为提高龙须菜抗逆性及培育抗逆龙须菜品种提供了参考。     

雨生红球藻虾青素合成关键酶的原核表达及纯化

雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,在胁迫条件下积累虾青素含量能达到细胞干重的5%。八氢番茄红素合成酶(PSY)、β-胡萝卜素酮化酶(CRTW)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTZ)是雨生红球藻虾青素合成的关键酶,本研究分别以雨生红球藻的DNA和cDNA为模板,克隆了这三个基因,并构建不同的原核表达载体pET-24a-crtw,pET-24a-crtz,pET-24a-psy。转化大肠杆菌Rosetta感受态,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blotting结果显示三种重组蛋白都能够正常表达,利用6×His标签对重组蛋白进行纯化能得到相对单一的条带,相对于纯化前目的条带明显加深。ELISA检测重组菌株E.coli RZ,E.coli RW,E.coli RP中的酶活性分别为3.0,10.5,10.0 IU/L,纯化后酶活性显著提高,分别为125.5,124.7,118.0 IU/L。本研究获得了这三种酶的活性重组蛋白,为其功能分析和抗体制备奠定了基础。     

三斑石斑鱼(Epinephelus trimaculatus)两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

通过设计引物,从三斑石斑鱼的卵巢中克隆鉴定出性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的cDNA序列,EtP450arom a开放阅读框为1557bp,编码519个氨基酸残基;EtP450arom b开放阅读框为1530bp,共编码510个氨基酸残基;性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的氨基酸序列的同源性为63.3%,并且包含了芳香化酶经典的功能保守结构。构建了芳香化酶的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法研究了性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)在雌性成鱼各组织中的mRNA的表达情况。组织表达结果显示,性腺芳香化酶EtP450arom a只在性腺中特异性表达,而脑芳香化酶EtP450arom b主要在脑区和垂体中表达,表明三斑石斑鱼两种芳香化酶基因的组织特异性及功能的差异。     

团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定

采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。     

整体原位杂交法研究斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育过程中胸苷酸合成酶(TS)的表达

收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的TS反义RNA探针,采用整体原位杂交方法研究胸苷酸合成酶(TS)基因在斑马鱼胚胎发育各期的时空表达状况.结果表明,在所取样的各个阶段,TS基因均有转录,但其部位不同,中囊胚过渡前后mRNA显现的部位仅存在于受精卵的动物极,10hpf时存在于整个胚胎的外围,至24hpf后集中...     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼头酸溶性与酶溶性胶原蛋白的分离纯化及理化性质研究

利用酸溶法和酶溶法制备马面鲀鱼头酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对所制备的ASC和PSC的氨基酸组成、SDS-PAGE、红外光谱、黏度和热变性温度,以及溶解度等性质进行分析。结果表明:马面鲀鱼头中ASC和PSC的提取率分别为0.94%±0.07%和3.91%±0.14%。Gly(265.0和251.8残基/1000残基)、Ala(111.0和107.6残基/1000残基)和Pro(87.0和83.1残基/1000残基)含量较高,而His和Tyr的含量较少,且未检测到Cys。ASC和PSC中亚氨基酸(Pro和Hyp)含量为169.3和160.6残基/1000残基。氨基酸组成分析、SDS-PAGE和红外光谱(FTIR)证实ASC和PSC均属于I型胶原蛋白,热变性温度分别为17.6°C和16.5°C。在酸性p H值范围内,ASC和PSC的溶解度较高;当Na Cl溶液浓度高于2%,ASC和PSC的溶解度会显著降低。综上,相对于哺乳动物类胶原蛋白,马面鲀鱼头ASC和PSC的亚氨基酸含量和热变性温度较低,结构稳定性差,易于降解,可作为胶原蛋白肽的制备原料进行开发。     

鲫鱼(Carassius auratus)半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因克隆及其表达研究

本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,采用巢式PCR和RACE技术克隆鲫鱼半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因c DNA序列,并且利用实时荧光定量PCR检测了CSAD m RNA在鲫鱼不同组织和昼夜节律中的相对表达水平,同时还研究了牛磺酸对鲫鱼肠道CSAD m RNA表达的影响。结果表明:(1)鲫鱼CSAD基因c DNA序列包含186bp的5?UTR序列,675bp的3?UTR序列,1503bp开放阅读框,编码500个氨基酸。同源性分析表明,鲫鱼和鲤鱼的同源性为97.2%。系统发育分析表明,鲫鱼与鲤鱼之间的亲缘关系最接近,置信度为100。经预测,其编码的蛋白质的分子量和等电点分别为56.82k Da和5.77;(2)Ca CSAD m RNA在肌肉、心脏、肠道及肝脏中的表达水平较高,在脑和鳃组织中的相对表达量较低;(3)鲫鱼肠道CSAD m RNA的相对表达量在6:00am点时最高,9:00pm点时相对表达量最低;(4)鲫鱼CSAD的相对表达丰度随着牛磺酸添加量的增加而逐渐下降。本研究结果不仅有助于理解鲫鱼CSAD基因的分子特征,同时将为进一步研究鱼类CSAD营养调控功能提供理论依据。     

水体铜对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)代谢酶活力的影响

采用生态学单因子梯度试验方法,研究了水环境中添加0·01、0·10、1·00、5·00mg/L的铜(Cu2 )对中华绒螯蟹肝胰腺、血淋巴和鳃代谢酶活力的影响。结果表明,随着Cu2 浓度的增高,肝胰腺和血淋巴的铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活力和血蓝蛋白均呈先增加后减少的变化趋势。鳃钠钾三磷酸腺苷酶(Na ,K -ATPase)、钙镁三磷酸腺苷酶(Ca2 ,Mg2 -ATPase)和谷丙转氨酶(GPT)活力均随着Cu2 浓度的增高而降低。随着Cu2 浓度的增高,肝胰腺髓性过氧化物酶(MPO)活力呈先减少后增加的变化趋势。水环境中添加0·01mg/L Cu2 就可对中华绒螯蟹代谢酶产生显著影响,并随着Cu2 浓度的增高,对中华绒螯蟹机体的影响逐渐加剧。表明代谢酶活力的变化可以灵敏地反映Cu2 的胁迫程度和毒性。     

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)两种催乳素受体基因的 cDNA 克隆和 mRNA 表达分析

采用RT-PCR方法克隆了斜带石斑鱼两种催乳素受体(Prolactin receptor,PRLR)的cDNA序列,序列分析表明:PRLR1开放阅读框为1947bp,共编码649个氨基酸,PRLR2开放阅读框为1749bp,共编码487个氨基酸,PRLR1与PRLR2的氨基酸同源性为40.4%。用Real-time RT-PCR方法研究了PRLR1和PRLR2在各组织和早期发育不同阶段的表达情况,结果表明:PRLR1和PRLR2在所检测的12种组织中均有表达,其中以鳃、肾、肠表达量较高;PRLR1在受精期表达最高,PRLR2在视囊形成期表达最高,而且除受精卵期外PRLR2在各时期的表达量均高于PRLR1。     

利用代谢组学揭示脱落酸对高温胁迫龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)的作用机制

大型经济海藻龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)在我国南北方海域广泛栽培,但其栽培周期与产量受到夏季高温天气的制约。植物激素脱落酸(ABA)在高等植物生长发育和抗逆胁迫中发挥了重要作用,但在藻类中研究较少。为揭示ABA对高温胁迫下龙须菜的保护作用及其潜在的作用机制,采用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)研究了外源ABA对高温胁迫下龙须菜代谢产物的影响。结果表明,ABA处理72 h后龙须菜中104种代谢物发生变化,其中黄嘌呤、次黄嘌呤、芦丁、精氨酰琥珀酸等26种代谢物含量升高,而23种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和35种溶血磷脂酰胆碱(LPC)含量下降;嘌呤代谢、黄酮和黄酮醇合成以及抗坏血酸和醛酸盐代谢这3条代谢通路受ABA影响显著。最后,利用生理生化方法检测了黄嘌呤对高温胁迫下龙须菜生长速率和活性氧(ROS)的影响,以及ABA添加后两种溶血磷脂代谢酶活性、精氨酰琥珀酸合成酶及其基因表达的变化,发现藻的生长、酶活性或基因表达变化等与代谢组结果相吻合。可见,ABA可以通过激活嘌呤代谢、黄酮和黄酮醇合成以及抑制溶血磷脂合成等来保护高温胁迫下的龙须菜。研究结果丰富了藻类中植物激素抗逆胁迫的资料,为龙须菜耐高温品系选育提供了新的思路。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

条斑紫菜Tubulin和Kinesin基因家族鉴定及失水胁迫表达模式分析

微管是细胞骨架的主要成分,其结构及动力学机制对提高生物体耐受性具有重要作用。微管网络如何通过结构的动态变化调控适应环境变化已成为胁迫生物学领域的研究热点之一。条斑紫菜(Pyropiayezoensis)能够适应潮间带复杂多变的环境,是研究潮间带大型海藻抗逆机制的良好材料。目前对紫菜微管相关基因家族构成及其生物学功能的研究较少。本研究利用生物信息学方法,在条斑紫菜基因组中共鉴定出4个Tubulin基因(Pyα-tubulin 1、Pyα-tubulin 2、Pyβ-tubulin和Pyγ-tubulin)和11个Kinesin基因(PyKinesin1—PyKinesin11),并对其理化性质、基因结构、蛋白特征、染色体定位、系统进化和失水胁迫下的表达模式进行了系统分析。结果显示:条斑紫菜中有3种微管蛋白(Tubulin)亚型;该家族成员散布于1号和2号染色体上, Pyα-tubulin 1和Pyα-tubulin 2为串联重复基因;PyTubulin家族成员在基因结构和蛋白特征方面均较为保守,且在转录水平对失水胁迫不敏感。条斑紫菜中有5种驱动蛋白(Kinesin)亚型,亚家族种类和基因数量均少于高等植物;该家族基因散布于1号、2号和3号染色体上,无串联重复基因; PyKinesin家族成员在基因结构和蛋白特征方面存在一定差异,PyKinesin1在中高度失水胁迫下表达量显著上调。本研究为进一步理解Tubulin和Kinesin基因家族的进化和功能、解析微管在条斑紫菜响应失水胁迫中的作用奠定了基础。     

条斑紫菜PyMGST3基因克隆、表达及功能分析

微粒体谷光甘肽硫转移酶(microsomal glutathione S-transferases,MGST)作为膜结合蛋白之一,具有谷光甘肽转移酶和过氧化物酶活性,在细胞及细胞器的抗氧化胁迫中扮演着重要角色,但MGST基因在紫菜(Pyropia yezoensis)中的鉴定与分析还未见报道。本文采用RACE-PCR方法首次克隆了条斑紫菜的微粒体GST基因的全长,命名为PyMGST3,同时利用生物信息学及实时定量PCR方法对该基因的序列及诱导表达特征进行了分析,并通过原核表达进一步验证了该基因的酶活性及在抗氧化胁迫中的作用。结果表明,PyMGST3基因的c DNA序列全长为681bp,其中开放阅读框长度417bp,5'-UTR长度80bp,3'-UTR长度184bp,在受到Cd~(2+)和Cu~(2+)胁迫时,上调表达;PyMGST3蛋白具有三个跨膜结构域及跨膜疏水区,与皱波角叉菜的MGST蛋白相似性最高为60%,与其它藻类的MGST蛋白的相似性较低;在大肠杆菌中表达及纯化后的PyMGST3蛋白具有谷光甘肽转移酶活性;此外,超表达PyMGST3蛋白的重组菌株提高了对抗Cd~(2+)和Cu~(2+)毒害的能力。这些结果暗示PyMGST3基因很可能在条斑紫菜遭遇重金属等引起的氧化胁迫时起到重要的保护作用。     

龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）中多种植物激素的GC-MS检测及对氮胁迫的响应

以海洋红藻龙须菜为材料,建立了5种内源性植物激素吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、肉桂酸（RA）的GC-MS微量检测方法,并运用该方法初步研究了龙须菜中5种植物激素对不同浓度氮胁迫的响应规律。结果表明,最优的实验条件为：样品用正丙醇：水：HCl（2：1：0.002）提取,HLB固相萃...     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

离体培养的虫黄藻(Symbiodinium voratum)对温度和光照的生理响应

虫黄藻是珊瑚礁生态系统中最主要的初级生产者,并在珊瑚礁的建造过程中起着关键作用。为探究虫黄藻对温度和光照的生理响应,本研究以E型虫黄藻（Symbiodinium voratum）为实验对象,通过室内培养,并结合谢尔福德耐受性定律建立了基于温度的虫黄藻生长速率的耐受性模型。结果显示：E型虫黄藻在光强90μE培养下,最适生长温度为22.56℃,适温范围为16.72—28.40℃;温度培养实验中,23℃时,虫黄藻中有机碳（C）、氮（N）积累最多; 27℃时,虫黄藻PSⅡ的原初光能转化效率（F_v/F_m）显著高于其余两个温度组;光照培养实验中,E型虫黄藻在温度23℃培养下,光强的适宜范围为100—200μE;并通过提高细胞内叶绿素a含量和F_v/F_m两种方式应对外界光照不足。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)蛋白质二硫键异构酶SmPDIA3的表达分析和功能验证

本研究利用SMART-RACE技术克隆了大菱鲆SmPDIA3基因。SmPDIA3基因cDNA序列全长2083bp,包括1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,GenBank登录号：MG765516。组织表达分析发现：SmPDIA3基因在肠、鳃、肝脏等组织中均有表达,其中在肝脏中表达量最高,脑中最低。进一步研究了温度胁迫后SmPDIA3基因在肠和肝脏组织中的表达变化规律,发现随着胁迫温度的升高,SmPDIA3基因的相对表达量总体上升,并在28℃时达到最大。利用原核表达技术,构建了pET-28a-PDIA3原核表达载体,IPTG诱导后融合蛋白主要在上清中表达。将上清中的蛋白分离纯化后,利用Western blot技术验证了目的蛋白的准确性。将纯化后的目的蛋白浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白浓度为243.18μg/mL。最后设计变性溶菌酶的复性实验,验证了SmPDIA3蛋白具有分子伴侣功能,能够辅助变性蛋白的正确折叠。