淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的 建Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法.方法 以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR),并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定.结果 构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性迭10-7 水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批问变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%.结论 建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

实时定量PCR检测Bcl-2/IgH融合基因在淋巴瘤中的应用

Bcl-2/IgH融合基因是淋巴瘤的肿瘤特异性标志,见于85%～90%的滤泡性淋巴瘤及30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。大量研究表明,该融合基因与滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤有很好的相关性,对Bcl-2/IgH的定量检测能反应淋巴瘤的临床进程。现就实时定量PCR技术对Bcl-2/IgH融合基因的检测在淋巴瘤的分期、疗效评价、预测复发和预后评估等方面的临床意义进行综述。     

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法，以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR，构建含有DNA甲基化β-aetin的重组质粒，克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测，建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化，60例宫颈癌标本的甲基化率为28．33％（17／60）。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。     

三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

实时定量PCR检测内质网应激相关基因方法的建立

从人外周血白细胞中扩增目的基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数。所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段。     

Quantitative PCR detection of endoplasmic reticulum stress associated genes

从人外周血白细胞中扩增目的 基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数.所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段.     

FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测小鼠肝癌模型中细胞周期蛋白cyclin E mRNA的方法。方法:以cyclin E和β-actin的PCR产物为阳性模板,分别将二者cDNA产物进行10倍梯度稀释,建立双标准曲线,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测cyclin E和β-actin mRNA含量,对熔解曲线进行分析确定扩增产物的特异性。结果:建立的标准曲线线性关系良好,相关系数r均为-1.00,cyclin E和β-ac-tin扩增效率分别为0.91和0.93,熔解曲线分析显示均为单峰,特异扩增产物的Tm值分别为(81.84±0.28)℃和(89.15±0.26)℃。10-4Cyclin E和β-actin cDNA标本日间变异系数(CV)和批内CV分别为1.02%、1.45%和0.90%、1.48%。结论:SYBR Green I实时荧光PCR定量检测cyclin E mRNA是一种方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好的方法,为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础。     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

目的：建立检测大鼠P物质（SP）mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法，为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段。方法：提取大鼠中脑总RNA，扩增SP基因片段，将其克隆入pMD-18T载体，制作标准品质粒；应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析，评价所建立方法的检测灵敏度；对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性。结果：标准品质粒构建成功，经酶切及测序鉴定，目的片段已插入pMD-18T载体；所建立的实时定量PCR方法的最低检测限度为10⁴个拷贝/反应，在每反应10⁴～10⁹拷贝范围内，Ct值（荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系，r=0.998。结论：所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点，适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila方法研究

目的 建立实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）的方法,为A. muciniphila的定量检测及深入研究提供技术支持。 方法 建立SYBR Green Ⅰ 荧光PCR 定量检测A. muciniphila的方法,利用A. muciniphila标准品制备标准曲线,评价该方法的灵敏度、特异性、抗干扰性及重复性,并对30例人粪便样本进行检测。 结果 标准曲线线性关系良好（R2=0.999）;方法灵敏度可达到1.0×102CFU/mL;该方法可特异性扩增A. muciniphila,不受其他肠道细菌的影响;组内和组间重复性较好,Ct值的变异系数均小于2%;30例人粪便样品中A. muciniphila阳性率为73%,Ct值为17.40～31.77。 结论 本研究建立的实时荧光PCR定量检测粪便中A. muciniphila的方法简便、快速、经济,且具有良好的灵敏度、特异性、抗干扰性和重复性,适用于实际粪便样品的检测。     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒基因方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光PCR快速检测登革热病毒的方法。方法以通用引物对标准株提取物和血清样本进行RT—PCR扩增，同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增，分析其灵敏性特异性和重复性。结果标准毒株的扩增结果与预期结果相同，测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致。实验的灵敏性特异性和重复都较高。结论SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法，但它更适用于早期传染病监测。     

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响

目的 建立SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响.方法 提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR Green Ⅰ Real-time PCR 检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性.运用建立的SYBR Green Ⅰ 方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较.结果 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107~102copies,检测灵敏度可达102copies.IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性.SYBR Green Ⅰ 方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义.结论 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要.     

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

目的：建立慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia ,CML）患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M（ b2a2,b3a3）及ABL的基因序列,分别设计引物及Taqman探针,以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板,通过PCR扩增出587 bp的基因片段,连入pMD 18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法,以ABL为内参,对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测,得到比较稳定的定量数据,与定性结果一致。结论自行构建BCR-ABL质粒为标准品,运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化,敏感性好,稳定性高,对临床检验具有普遍意义。