环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hly A毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明:纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×10~0CFU/m L,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×10~1CFU/m L,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究

建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测

通过扩增hly基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR方法.该方法具有较强的特异性,35株经传统方法鉴定的菌株PCR结果均为阳性,而其他三种同属异种菌,包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段.PCR方法对上Lm纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl,对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g,牛奶为4CFU/ml.应用该方法对285份食品样品检测,17份样品Lm呈阳性,结果与常规的分离培养方法完全一致.该种方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中Lm的快速检测.     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究

本研究建立一种改良环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测鸡肉中单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)的方法。针对单增李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)设计LAMP引物,对单增李斯特氏菌进行特异性检测,通过荧光曲线和肉眼观察荧光颜色来判定检测结果。试验结果表明:改良LAMP方法检测单增李斯特氏菌具有良好的特异性,7株单增李斯特氏菌呈阳性结果,24株非单增李斯特氏菌呈阴性结果。与聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法相比,改良LAMP方法具有灵敏度高(5.4×100 fg/μL)、检出限低(3.9×100 CFU/g)的特点,均是PCR结果的100倍。对66份鸡肉样品进行检测,得到改良LAMP方法的敏感性为100%,特异性为98.41%,符合率为98.48%。综上所述,改良LAMP方法能够快速、准确的检测单增李斯特氏菌,具有很好的应用前景。     

七类食品单核细胞增生性增李斯特菌污染状况调查

利用李斯特显色培养基对食品中单增李斯特菌进行分离纯化后,提取基因组DNA,用PCR技术扩增hlyA基因特异性350bp的片段和iap基因特异性1500bp的片段,用此方法对七类食品进行检测。结果表明,冬春夏三季采集的62、60、62份样品中,分别检出单增李斯特菌3株、3株、10株,污染率分别为4.84%、5%、16.13%。夏季单增李斯特菌的污染情况比冬季和春季严重,其中蔬菜和牛奶中未检出单增李斯特菌;PCR检测可用于单增李斯特菌快速、特异、敏感检测。     

环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

建立了一种快速检测灭菌乳中单增李斯特菌的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法。以hlyA基因作为靶基因,对人工污染乳中单增李斯特菌进行了LAMP方法的灵敏度试验,同时与PCR方法进行比较。并对单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌进行了LAMP检测,以验证该方法的特异性。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的特异性强,检出限为42 mL-1,其灵敏度比普通PCR高10倍。并且检测时间比PCR更短,在1.5 h内即可完成扩增反应。此方法快速、特异、简单、灵敏,具有较高的推广价值。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

食品中单增李斯特菌PCR-NALF检测方法

建立了一种快速检测单增李斯特菌的聚合酶链式反应-核酸层析(PCR-NALF)方法,该方法通过一对标记生物素和地高辛的引物,对提取自样品中的DNA进行扩增,然后用包被亲和素和抗地高辛抗体的层析试纸条对扩增产物进行检测,并通过肉眼可见的红色条带进行结果判读,从而替代电泳实现便捷检测。在特异性试验中,其他李斯特菌和常见致病菌均呈现阴性反应,与电泳结果一致。与传统微生物检测法(GB/T 4789.30-2008)相比无显著性差异(χ~2=0,P>0.05)。     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

冻虾类海产品中3种致病菌的多重PCR快速检测技术的建立

建立快速检测冻虾类海产品中沙门氏菌(Salmonella typli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重PCR方法。根据3种致病菌的靶基因,分别设计了3对引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了三重PCR检测虾类海产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的方法,实现了对这3种致病菌的同时检测。该方法操作简单,检测周期短,具有灵敏度高、特异性强等优点,能够快速地实现对海产品中多种致病菌的诊断和监控。     

改良FTA-PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的：建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生性李斯特氏菌的PCR 检测方法。方法：以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA 基因作为靶序列设计一对引物,运用改良的FTA-PCR 法对单核细胞增生李斯特氏菌进行鉴定和检测。结果：扩增产物为136bp 的片断,此方法较原有方法灵敏度增强,可达到1.1 × 102CFU/ml。结论：改良的FTA 卡法特异性强、灵敏度高,有效缩短了检验周期,从传统的7～14d 缩短到1～1.5d。     

PCR法检测鱼及其制品中的鱼源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的鱼源性成分聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法:根据鱼线粒体基因组12S r RNA中的保守序列设计鱼源性特异性引物,进行PCR扩增,建立鱼源性成分检测方法;对24种鱼及鸡、牛、羊、猪、鸭、虾6种常见的易混于鱼制品的动物源性成分进行特异性检测;将草鱼肉混入其他动物肉中,混合均匀后提取DNA进行PCR扩增,确定肉样水平的检测灵敏度;将草鱼DNA混入其他动物DNA中,以混合后的DNA为模板进行PCR扩增,确定DNA水平的检测灵敏度。结果:该方法能特异性的对鱼源性成分进行快速检测,检测灵敏度达0.5%。结论:该方法能对食品中是否含有鱼源性成分进行初筛,到达快速检测的目的,对防止食品掺假、维护消费者利益、规范市场秩序有重要意义。     

实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌

目的建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法。方法针对单增李斯特菌溶素A基因（hlyA）设计一对引物和一条探针，并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测。结果利用实时荧光PCR技术，建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线。DNA校正曲线在1～32CFU/ml、细胞校正曲线在32—320CFU／ml、质粒校正曲线在1—37Copies／ml，线形关系良好，且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合。结论本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.