组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞

目的 探讨防止血管吻合口血栓栓塞的新方法,了解组织型纤溶酶原激活物基因疗法防止吻合口血栓栓塞的效果。方法 （1）将含有t-PA基因的重组质粒pAdCMVt-PA与缺陷型腺病毒大框架pJM17共转染病毒包装细胞293细胞,获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒AdCMVt-PA。（2）实验动物随机分为对照组和治疗组,均用11－0尼龙缝线行大鼠颈总动脉原位端端吻合,治疗组吻合口注射AdCMVt-PA溶液,对照组注射AdCMV(不含t-PA的空载体）,提取吻合口组织的总RNA行RT－PCR,应用发色底物法检测吻合口组织的纤溶酶活力。结果 治疗组RT－PCR在2．0kb前面有一条带,对照组则没有,治疗组术后第2,3,5,7和14日均可检测到纤溶酶活力,但第3日活力最高,对照组未检测到纤维溶酶活力,结论 克隆入 病毒载体的p-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的t-PA,可能有效地抑制吻合口血栓形成,提高吻合口通畅率。     

内皮型一氧化氮合酶基因与冠心病

冠状动脉粥样硬化性心脏病 (简称冠心病 )是由遗传与环境因素共同所致的复杂疾病。分子遗传学的发展 ,为分析冠心病的遗传机制提供了可能。内皮细胞一氧化氮作为心血管功能上一种重要的调节分子 ,与冠心病的发生、发展有关［１］。一氧化氮合酶(ＮＯＳ)是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶 ,其基因的突变可能影响ＮＯＳ蛋白的功能及活性 ［２］。ＮＯＳ基因被列为冠心病的一个候选基因［３］。因此 ,ＮＯＳ基因的突变可能与冠心病及心肌梗死风险有关 ,且已有证据证明此相关性 ［２ ,４～６］。人体内ＮＯＳ至少有３种 :内皮型 (ｅＮＯＳ)、神…     

尿激酶原基因疗法防治血管吻合口内膜增生的实验研究

为了探讨防止血管吻合口内膜增生的新方法，了解尿激酶原（ｐｒｏ－ｕｋ）基因疗法对吻合口内膜增生的影响。方法用浸泡过ｐＮ２－ｐｒｏ－ｕｋ质粒溶液的１１／０医用尼龙缝线进行大鼠颈总动脉原位端端吻合。实验动物随机分为对照组和治疗组。对照组应用的缝线浸泡过ｐＮ２质粒溶液，治疗组应用的缝线浸泡过ｐＮ２－ｐｒｏ－ｕｋ质粒溶液。提取吻合口组织的ＲＮＡ与ｐｒｏ－ｕｋ探针，进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交，应用纤维蛋白平板溶圈法检测吻合口组织的纤溶酶活力，并进行粘附于吻合口同位素标记的血小板计数，吻合口同位素掺入量和病理形态学检测等观察。结果治疗组Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交在１８Ｓ稍下方有一杂交带，对照组则无这杂交带。治疗组术后２、７、１４天和９０天均检测到纤溶酶活力，术后第７天活力最高，对照组则未检测到纤溶酶活力，治疗组粘附于吻合口同位素标记的血小板数目、３Ｈ－ＴｄＲ掺入量、吻合口内膜面积均明显少于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论用浸泡过ｐＮ２－ｐｒｏ－ｕｋ质粒溶液的医用缝线进行血管吻合，ｐｒｏ－ｕｋ基因可在吻合口组织中表达出有生物活性的ｐｒｏ－ｕｋ，并能有效地抑制吻合口内膜增生。其机制与减轻吻合口血小板沉积和粘附有关。     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（eNOS)基因的重组腺病毒载体。方法：将eNOS cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pCA14，得到重组质粒pCA14-CMV-eNOS。采用磷酸钙－DNA沉淀法将质粒pCA14-CMV-eNOS与腺病毒拯救质粒pBHG10共转染293细胞，通过同源重组，生成带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMVeNOS)。eNOScDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。结果：经形态学、病毒DNA酶切、PCR和RT－PCR等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有eNOS基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性.方法 密度梯度离心法分离ICR小鼠骨髓来源单个核细胞培养制备小鼠EPC并鉴定;构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL-1细胞悬液,按0.6 mL/孔重新铺6孔板,待细胞生长至80％左右融合时,用脂质体LipofectamineTM 2000体外转染eNOS基因至EPC.转染48 h后,采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达,硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量,荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量.结果 成功培养EPC,成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体.转染48 h后,EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01),NO含量明显升高(P＜0.01),ROS含量明显降低.结论 脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC,并能在EPC中有效表达.     

内皮型一氧化氮合酶基因多态性对一氧化氮水平的影响

一氧化氮(NO)是重要的细胞间信号转导分子,参与体内各种生理、病理过程。一氧化氮合酶是合成体内一氧化氮的关键酶,其中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是重要的关键酶之一。eNOS是由eNOS基因翻译、转录而来。近年来,eNOS基因多态性研究成为分子生物学和基因组学的重要热点,该文就eNOS基因多态性与体内NO水平的关系予以综述。     

内皮型一氧化氮合酶基因多态性与脑梗死的研究

一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)的一个重要指征是不仅合成一氧化氮(Nitric Oxide，NO)，也能产生超氧离子。目前已确定的NOS的亚型有三种，根据不同的基因编码分别称为神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、诱导型NOS(inducibl eNOS，iNOS)、内皮型NOS(endothel ialNOS，eNOS)。三种NOS亚型在血管内皮细胞中均可表达，但在生理情况下，血管内皮细胞中的eNOS合成和释放NO无疑是血管张力的主要调节因子。而nNOS与iNOS产生的NO则主要产生氧化作用，具神经毒性作用。     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化.方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况.结果 RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120 h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05).转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异.结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定.     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。     

超短波治疗对鼠断尾再植后鼠尾内皮素的影响

目的探讨超短波（ultra—shortwave,USW）治疗对鼠断尾再植后血管危象的影响及作用机制。方法动物实验从2009年10月至2010年6月实施。取3个月龄雌性成年sD大鼠80只,体质量232．8-289．6g,完全随机化分为5组。各组保留尾侧静脉、尾骨后断离尾,空白组结扎尾动脉;对照组、罂粟碱组、USW高剂量组、USW低剂量组均吻合尾动脉,建立断尾再植模型。术后对照组正常饲养管理,不给任何治疗措施。罂粟碱组术后立即腹腔内注射稀释的盐酸罂粟碱注射液。USW高剂量组、USW低剂量组术后20min立即给予局部吻合口处USW治疗,此后每天1次,至术后5d。USW高剂量组USW剂量：3档,50mA,20min。USW低剂量组剂量：2档,28mA,20min。术后观察鼠尾成活情况至术后10d。手术前后测鼠尾吻合口近远侧皮温差并计算术后与术前的变化值。术前从内眦及术后第8小时从尾尖各采血1次,测血浆内皮素（endothelin,ET）浓度并比较。结果鼠尾成活率：所有鼠分2组,断尾组（空白组）0％（0／14）,断尾再植组（对照组-usw低剂量组）44％（29／66）,组问差异有统计学意义（P〈0．05）。5组鼠尾成活率分别为0％（0／14）、36．4％（8／22）、57．1％（8／14）、22．2％（4／18）、75．0％（9／12）,总体比较差异有统计学意义（P〈0．05）。断尾再植的各组（对照组、罂粟碱组、USW高剂量组、USW低剂量组）总体比较差异有统计学意义（P〈0．05）。断尾再植各组两两比较：USW低剂量组〉对照组,USW低剂量组〉USW高剂量组,罂粟碱组〉USW高剂量组,差异均有统计学意义（P〈0．05）;余2组间差异无统计学意义（P〉0．05）。术前鼠尾皮温差两两比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。术后第8小时、5天、6天及7天鼠尾皮温差变化值各组差异均有统计学意义（P〈0．05）。两两比较：其中术后第8小时,USW高剂量组〈对照组。术后第5天,USW高剂量组〈罂粟碱组。术后第6天,USW高剂量组〈空白组、对照组、罂粟碱组。术后第7天,空白组、USW低剂量组〈对照组、罂粟碱组,USW高剂量组〈对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。其余各组间两两比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。术前各组血浆ET含量差异无统计学意义（P〉0．05）。术后第8小时,ET减少量总体比较：USW低剂量组〉罂粟组〉USW高剂量组〉对照组〉空白组,P=0．004。两两比较：USW低剂量组、罂粟碱组与空白组、对照组,USW高剂量组与对照组,差异有统计学意义;余差异均无统计学意义。结论实验大鼠断尾再植模型可行。USW治疗,能提高鼠断尾再植存活率,在术后第8小时、5天、6天、7天,能减小皮温差,减少术后第8小时的ET浓度,防治血管危象。     

反义寡核苷酸防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的机制探讨

目的　探讨医用生物蛋白胶携载c myc反义寡核苷酸防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的机制。方法　将 8只新西兰大白兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后 ,随机分成实验组及对照组。对照组静脉间置后即缝合伤口 ;实验组将 30 0 μg反义c myc涂于2 .5ml医用生物蛋白胶中 ,并均匀涂于血管吻合口外周。术后 7d取材 ,提取组织总RNA ,进行RT PCR和NorthernBlot分析 ,图像扫描后进行计算机分析。结果　RT PCR显示实验组的c myc扩增产物量明显低于对照组 ,产物半定量分析提示两者差异有显著性 (P <0 .0 1) ;NorthernBlot图像扫描分析显示实验组的积分密度值 (2 .2 5± 0 .16 )明显低于对照组 (4.6 3± 0 .4 8) (P <0 .0 5 )。结论　反义c myc可通过碱基互补与其相应基因结合 ,封闭该基因的表达 ,使其促细胞增殖作用减弱 ,最终达到防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的目的     

转染组织型纤溶酶原激活物基因质粒预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的探讨应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型,构建tPA基因质粒并制备tPA基因缝线,在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞,采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-BmRNA表达以及内膜增生的影响。结果成功转染tPA基因并显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-BmRNA,抑制率分别为75.16%和87.01%;显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成,使吻合口狭窄率显著减少70.30%。结论转染tPA表达质粒在可抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄,这为冠状动脉搭桥术后再狭窄的防治提供实验基础。     

靶向转染纳米tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的研究

目的探讨构建的白蛋白纳米组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因质粒超声微泡载体靶向转染心肌组织预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型,制备tPA基因白蛋白纳米超声微泡,超声波靶向转染心肌并获得tPA表达,观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和PDGF-BmRNA表达以及内膜增生的影响。结果成功靶向心肌转染tPA基因并获得了tPA基因有效表达。显著减少了动脉搭桥吻合口血栓形成,抑制率100%。抑制冠状动脉吻合口处内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA。显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积,使吻合口狭窄率减少68.29%。结论白蛋白纳米-超声微泡载体靶向转染tPA基因可预防狗冠状动脉搭桥术后吻合口血栓形成和再狭窄,这为人冠状动脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的防治提供实验基础。     

重庆市高血压病人内皮一氧化氮合酶基因G894T多态性研究

目的：观察高血压病（EH）病人内皮一氧化氮合酶（eNOS）基因G894T多态性，探讨eNOS基因在EH发病机制中的作用。方法：EH病人226例，设对照组。取血标本提取DNA，用PCR方法扩增目的基因，用限制性内切酶（BanⅡ）酶切PCR产物用于基因分型，分析基因型与血压关系。结果：eNOS各基因型（GG、GT或TT）在EH组与对照组中的分布无显著差别（P＞0．05）。Logistic回归分析显示894T等位基因与高血压发病无关联，但T等位基因携带者尿素氮（BUN）较高（P＜0．05）。结论：eNOS基因G894T多态性在EH发病中无直接重要作用，但可能通过影响肾功能而影响EH易感性。     

Preventive therapy with isoniazid. Cost-effectiveness of different durations of therapy

Daily administration of isoniazid for one year to persons infected with Mycobacterium tuberculosis is effective in considerably reducing the risk of disease. From a practical viewpoint, this approach to prevention is less than ideal because it results in considerable costs as health care providers monitor for possible hepatotoxic effects and because it is difficult to maintain compliance for 12 months. The efficacy and toxicity of isoniazid preventive therapy regimens of 12, 24, and 52 weeks' duration were recently assessed in a study conducted in Eastern Europe. We used data from this study to conduct a cost-effectiveness analysis of the three alternative regimens. The results indicate that over a wide range of assumptions, a regimen of 24 weeks' duration is more cost-effective than either the 12- or 52-week regimen. Using base case estimates, the cost per case prevented for the 24-week regimen was $7,112, compared with $16,024 for the 52-week regimen. Among a cohort of 1,000 persons treated, each additional case prevented by the 52-week regimen would cost $80,807. Thus, a shorter course of isoniazid preventive therapy is relatively cost-effective compared with current policy.     

Alphastatin多肽对胶质瘤血管生成拟态的抑制作用及其相关机制

目的探讨24肽Alphastatin对胶质瘤血管生成拟态的抑制作用及其相关机制。方法应用MTT、Transwell法、细胞三维培养和Western blot等方法检测Alphastatin对SHG44细胞增殖、迁移和血管形成能力的抑制作用及血管内皮生长因子(VEGF)、上皮细胞激酶(EphA2)、基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达。结果对照组细胞迁移数为178.71±18.81,实验组(100 nmol/L,1 000 nmol/L,10 000 nmol/L)细胞数目分别为142.57±12.12,92.71±17.68和30.00±7.72,对照组细胞数显著高于实验组(P<0.01);对照组拟态血管数目为56.80±12.21,也显著高于实验组(47.71±10.58,18.86±8.40,8.43±5.62),P<0.01。Alphastatin虽然能作用于VEGF通路,却不能直接抑制VEGF蛋白的表达,但是可明显抑制EphA2蛋白的磷酸化和MMP2蛋白的活化,减少血管生成拟态的形成。结论 Alphastatin不但可抑制肿瘤血管内皮细胞依赖性血管,还能抑制血管生成拟态,可能是理想的肿瘤血管抑制肽。     

门脉高压患者血浆刺激血管内皮细胞eNOS与Hsp90相互作用的实验研究

目的：用门脉高压患者血浆刺激血管内皮细胞研究内皮型一氧化氮合酶（eNOS）与热休克蛋白90（Hsp90）的相互作用。方法：免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的一个有力工具。用肝硬化门脉高压患者血浆处理培养的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell，HUVEC）后，在0、15、30、60和120min时收集细胞，利用该技术检测对Hsp90和eNOS相互作用的影响。细胞裂解液分别用抗eNOS抗体和抗Hsp90抗体沉淀蛋白复合体．经SDS～PAGE电泳和转膜后，再分别用抗Hsp90抗体和抗eNOS抗体进行免疫识别。结果：本实验分别检测出了eNOS和Hsp90的表达,说明Hsp90和eNOS存在相互作用的关系。Hsp90和eNOS对刺激产生的反应有时相性，一般在刺激30min后Hsp90的量有明显增加，进一步说明Hsp90对eNOS调节NO的产生起关键的作用。结论：门脉高压患者血浆可以刺激血管内皮细胞Hsp90与eNOS结合，增强eNOS的生物活性，使NO释放增多。     

连续性肾脏替代治疗脑出血合并肾功能不全84例

目的:寻找脑出血、颅内高压合并肾功能不全患者控制颅内高压、避免肾功能恶化的理想方法。方法:84例脑出血合并肾功能不全患者分别进行常规治疗、连续性肾脏替代治疗(CRRT),治疗前后不同时间,计算内生肌酐清除率(CcR),行腰穿术测定脑脊液压力评估颅内压。结果:常规治疗患者5d后CcR进行性下降,肾功能恶化,颅内压高于CRRT治疗组;CRRT组除5例肾功能明显恶化外,其他病人肾功能稳定,颅内压高峰水平低于常规容量组。结论:CRRT治疗脑出血合并肾功能不全可有效避免肾功能恶化、控制颅内高压,是有效治疗手段。     

一氧化氮合成酶基因多态性与冠心病的关系

目的：测定中国汉族人群内皮型一氧化氮合成酶基因（eNOS）G894T多态性,研究其在中国汉族人群中的分布以及与冠心病的关系。方法：对127例冠心病患者和110例正常人检测eNOS基因多态性。结果：中国汉族人群eNOS基因有GG、GT、TT三种基因型,GT＋TT型与GG型和G、T等位基因频率在正常人和冠心患者中比较无差异（P〉0.05）。结论：中国汉族人群eNOS基因多态性与冠心病无关。