黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测。对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察。结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×10~3PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测。     

水霉菌环介导等温扩增检测方法的建立

【目的】建立一种快速简单检测水霉病病原菌的方法。【方法】针对水霉菌ITS区基因序列设计4条特异性引物,包括两条外引物和两条内引物,优化反应条件,观察检测结果。对该方法的特异性和敏感性进行研究。【结果】建立了环介导等温扩增技术检测水霉菌的方法,确定了其最适反应条件。该方法能够检测到浓度低至103个/mL的水霉菌孢子,其灵敏度是普通PCR方法的100倍。【结论】建立的检测水霉菌的LAMP技术,具有操作简便快速等特点,可用做特异性水霉及其孢子的快速鉴定。     

环介导等温可视扩增检测牛分枝杆菌方法的建立

目的:建立一种快速简便检测牛分枝杆菌的方法。方法:根据已发表的牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成6对特异扩增牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,通过条件优化,建立针对牛分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的牛临床样品的DNA分别进行检测。结果:采用该法只检出牛分枝杆菌,检测的最低拷贝数为1×102拷贝/μL。结论:建立的LAMP方法简便、快速、特异性高,可用于临床上牛分枝杆菌的快速检测。     

牡蛎单孢子虫环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的:建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的单孢子虫可视化检测方法。方法:根据尼氏单孢子虫的小亚基核糖体RNA保守序列,设计一套特异性LAMP引物,对反应条件如温度和试剂浓度进行优化,建立检测牡蛎单孢子虫的LAMP方法。结果:所建立的方法的敏感性可达1 fg,是常规PCR方法的100倍;全部反应可在1 h内完成;可通过肉眼观察颜色,直接判定结果;对其他牡蛎常见病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于牡蛎单孢子虫感染的快速检测。     

嵌合病毒技术在黄热病毒属病毒研究中的应用

嵌合病毒技术是用于RNA病毒研究的一个重要技术,近十年来在黄热病毒属病毒的研究中,构建了一些型内及型间的嵌合病毒,不仅有利于该属病毒的分子机制研究,更重要的是研制出一些新型减毒活疫苗.本文简单介绍该技术的原理、构建、影响因素、应用前景等.     

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。     

环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展

食品安全一直是全世界公众健康的关注焦点。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的等温核酸扩增技术,近年来在核酸检测领域有着广泛的研究和应用。将LAMP技术应用到食品安全检测领域,可以快速准确的监控一些食品安全问题,避免对人类健康所构成的危害。因此针对LAMP技术在食品安全检测方面的优势进行分析,并结合LAMP技术与新兴诊断技术平台的联合运用进行了展望。     

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展

综述了环介导等温扩增技术检测病毒、细菌和寄生虫等动物病原方面的研究和应用最新进展.     

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种快速、敏感、特异的检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区8个位点设计了6条特异性LAMP引物,以H6亚型AIV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,对反应条件和反应体系进行优化.结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应.该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01 pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法.