猪β干扰素成熟蛋白编码基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化

从猪肝脏中提取基因组DNA,利用PCR法直接扩增了猪β干扰素成熟蛋白编码基因。将PCR产物亚克隆至pGEM-7Zf( )载体,转化入大肠埃希菌TG1,筛选出阳性菌株后进行测序。序列分析结果表明,克隆片段含编码猪β干扰素成熟蛋白质的495个核苷酸,与GenBank上(登录号:S41178)的序列同源性达到100%。在此基础上,构建了猪β干扰素原核表达载体pQE30/poIFN-β并转化入大肠埃希菌M15。该工程菌在37℃经0.03mmol/LIPTG诱导4h后,进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约20ku的位置出现了明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经凝胶分析软件Bandscan分析,表达产物约占菌体总蛋白的18%。包涵体用6mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪β干扰素进行复性及活性研究打下了基础。     

蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因，并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株，分别在1．0mmol／LIPTG、37℃和0．1mmol／L IPTG、28℃条件下诱导，蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达，且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。     

大骨鸡HSP70蛋白的表达、纯化及质量检测

旨在构建鸡热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表达质粒p ColdⅡ-HSP70,诱导表达、纯化后检测HSP70蛋白的质量。将目的基因扩增后克隆至表达载体p Cold II,构建重组载体p ColdⅡ-HSP70,在2种大肠杆菌菌株(BL21(DE3)和Rosetta(DE3)p Lys S中经IPTG在不同温度与不同浓度条件下诱导表达并纯化。经SEC-FPLC和HPLC进行纯度鉴定,采用鲎试剂检测蛋白内毒素含量(将HSP70蛋白按1 200、600、120倍稀释);Western blot及质谱方法检测蛋白分子量。结果显示:酶切和测序结果均证实HSP70表达载体构建正确,可诱导表达。经IPTG诱导表达后确定BL21(DE3)在37℃条件下表达蛋白效果最佳,经检测HSP70蛋白的相对分子质量为71 988.04,蛋白纯度大于90%,内毒素小于500 Eu/mg。结果表明:成功构建了大骨鸡HSP70基因的表达载体,获得了纯化的HSP70蛋白,为进一步研究HSP70在热应激中的作用机制提供了基础。     

GST-P58IPK融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础.     

中性植酸酶的克隆、表达、纯化及酶学性质研究

基于454高通量测序枯草芽孢杆菌I4全基因组,获得一个编码中性植酸酶的基因Bpp,该基因全长为1 149 bp,编码382个氨基酸组成的多肽,成熟蛋白的理论相对分子质量为42 590.将基因Bpp克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠杆菌BL21( DE3)中表达,表达产物具有植酸酶活性,利用组氨酸标签纯化并初步研究其酶学性质.结果表明:酶作用的最适pH为7.5,最适温度为55℃,Km为38.76 mmol/L,Vmax为2.34 U/mg,比活力为6.054 U/mg,中性植酸酶活性依赖Ca2+.     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。     

鸡肌抑素基因的原核表达及蛋白纯化

利用实验室保存的重组质粒pMD18-MSTN重新构建原核表达质粒pET-32a-MSTN,将其转化到宿主茵大肠杆菌BL21上并进行诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.结果表明:该基因在宿主菌中成功表达;目的蛋白被成功纯化,且纯度较高.     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

巴泰病毒N5aa-90aa重组肽段的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科成员,其核衣壳N蛋白具有高度保守性,可诱导机体产生较好的抗体反应,常用做诊断抗原。本研究通过对N蛋白强抗原性肽段N_5aa-90aa进行密码子优化,将其插入到p ET-32a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,通过不同IPTG浓度和诱导时间确定最佳蛋白表达条件。利用镍柱亲和层析方法对r His-N_5aa-90aa肽段进行纯化。通过Western blot对r His-N_5aa-90aa肽段进行验证,将r His-N_5aa-90aa肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价。结果显示：本研究成功构建了p ET-32a-N_5aa-90aa重组质粒,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导5 h可获得大量重组蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示重组r His-N_5aa-90aa肽段分子质量约28.6 kDa,蛋白浓度为0.256 mg/mL;经Western...     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。     

鸡补体受体2基因克隆、蛋白表达纯化及其多克隆抗体的制备和鉴定

为初步鉴定鸡补体受体2（ChCR2）基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1 113 bp的ChCR2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温（16 ℃）诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512 000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。     

鸡EED基因的原核表达与生物信息学分析

本研究旨在获得鸡胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development,EED）原核表达蛋白,并利用生物信息学方法探索其潜在生物学功能。以提取的3日龄雏鸡脾脏总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增鸡EED基因,将其克隆至pET-32a （+）载体,构建重组表达载体pET-32a-EED,转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达;Western blotting检测经镍离子亲和层析法纯化的鸡EED蛋白,并利用在线软件对其进行生物信息学分析。结果显示,鸡EED基因序列全长1 341 bp,与参考序列（GenBank登录号：NM_001031376.1）相似性为99.85％;当诱导温度为28 ℃,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂诱导表达7 h时,可在重组菌裂解上清中纯化得到分子质量约70 ku的鸡EED融合蛋白。在线软件分析表明,鸡EED蛋白相对分子质量为50 377.92,理论等电点（pI）为6.54,为亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽序列,该蛋白序列与人多疏蛋白EED三级结构模板序列（6c23.1）相似,同样具有肿瘤靶点WD40结构域。结果表明,本研究成功获得大肠杆菌表达的鸡EED可溶性蛋白,且该蛋白具有重要的功能元件,可为深入探索鸡EED蛋白的生物学功能与调控机理提供材料。     

猪白细胞介素-18基因表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,并命名为pET41c-IL18和pET32c-IL18。将pET41c-IL18和pET32c-IL18转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。SDS-PAGE及W estern-blotting分析结果表明,所表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,pET32c-IL18重组蛋白分子质量约33 ku,与预期大小相符。将包涵体提取物用8 mol/L脲变性,经N i-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

鸡Smad4基因克隆、生物信息学及组织表达分析

试验旨在克隆鸡Smad4基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。以苏禽3号优质黄羽肉鸡为试验对象,使用RACE技术扩增并克隆了鸡Smad4基因全长序列,对其进行生物信息学分析,构建系统进化树,并利用实时荧光定量PCR检测了Smad4基因在鸡各组织中的表达情况。结果显示,鸡Smad4基因全长序列包含17 bp的5'UTR、1 842 bp的开放阅读框和466 bp的3'UTR,有11个外显子和10个内含子,mRNA序列全长2 325 bp,可编码613个氨基酸。系统进化树显示,鸡Smad4与其他鸟类聚为一类。生物信息学分析显示,Smad4蛋白分子质量为65.43 ku,理论等电点为10.04,为亲水蛋白;含有2个保守结构域：MH1和MH2;二级结构由α-螺旋（18.11%）、延伸链（17.29%）和无规则卷曲（64.60%）组成。组织表达分析表明,Smad4基因在鸡的心脏、肝脏、空肠、卵巢中均有较高表达,而在胸肌中不表达。本试验成功获得了鸡Smad4基因全长序列,并初步研究了其组织表达规律,为进一步研究Smad4基因在鸡繁殖活动中的分子机制提供了理论依据。     

鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

采集200日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织,直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行克隆、测序,获得新扬州鸡降钙素(CT)基因序列。测序表明,CT基因核苷酸长度为417bp,编码139个氨基酸。与GenBank上发表序列相比较,核苷酸同源性为99.8%,在第135位处存在G→C的有义突变。与从GenBank下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬8个物种序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为74.0%、63.3%、59.5%、55.6%、52.8%、50.6%、48%及42.2%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CT,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段且连接、构建正确,为利用pCEP4-CT调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。