抗烟草花叶病毒(TMV)生防菌的鉴定及其发酵条件优化

为有效防治烟草普通花叶病毒病(TMV),从土壤中分离筛选到1株抗TMV的细菌菌株Z5,经形态学、生理生化和分子生物学鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),该菌培养液对TMV体外抑制率达到96.40％,田间小区试验对烟草普通花叶病毒病的防效为50.43％.通过单因素法优化Z5发酵体系,最适培养基...     

贝莱斯芽孢杆菌F85对烟草炭疽病的生防作用研究

为明确贝莱斯芽孢杆菌对烟草炭疽病的生防作用,通过贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisF85和烟草炭疽病菌Colletotrichum fructicola共培养试验,测定了不同浓度的F85无菌发酵滤液（0.5%～20%）对C. fructicola的菌丝生长、分生孢子萌发及附着胞形成的影响,评价了F85对活体叶片的烟草炭疽病的防治效果。结果表明：（1）贝莱斯芽孢杆菌F85对C. fructicola、C. kahawae、C. karstii、C. siamense均表现出较好的拮抗作用,具有广谱抑菌效果。（2）贝莱斯芽孢杆菌F85可有效抑制烟草炭疽菌C. fructicola菌丝的生长,同时抑制炭疽菌分生孢子的萌发和附着孢形成。随F85无菌发酵滤液浓度升高,对C. fructicola的抑制作用更明显。20%F85无菌发酵滤液处理C. fructicola菌丝干质量抑制率和分生孢子芽管畸形率均达100%。（3）5%浓度以上的贝莱斯芽孢杆菌F85无菌发酵滤液对活体烟草炭疽病的防效高于70%。本研究丰富了烟草炭疽病生防菌资源,为开展烟草炭疽病的生物防治提供了理论依据。     

枯草芽孢杆菌Tpb55抗烟草普通花叶病毒（TMV）活性研究

利用三生-NN烟测定Tpb55菌悬液对烟草普通花叶病毒(TMV)钝化、预防和治疗作用,结果表明,Tpb55菌悬液对TMV具有较好的钝化、预防和治疗效果,枯斑抑制率分别为96.15%、79.72%和65.71%.选用易感TMV烟草品种K326为试验材料,测定Tpb55对TMV控病作用,结果表明,先接种Tpb55菌液再接种TMV的烟株,发病程度明显低于接种TMV再接种Tpb55菌液的烟株;不论在烟株接种TMV前或后,用Tpb55菌液处理烟株的叶片与只接种病毒烟株相比,叶片内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均显著提高,以接毒前Tpb55菌液处理的烟株活性水平最高.从本试验结果来看,Tpb55具较强的抗TMV活性,可通过直接接触钝化作用及诱导烟草抗病性米抑制TMV侵染.     

3个黑龙江烟区烟草花叶病毒分离物的全基因组序列测定与分析

为明确黑龙江烟区烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）分子株系和进化特征,从哈尔滨和牡丹江感病烟草采集到HEB1、HEB2和MDJ三个样品,通过RT-PCR扩增了其全基因组序列,并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析。结果表明,3个分离物全长均为6395核苷酸（GenBank登录号分别为MH595919、MH595920和MH595921）。HEB1和MDJ与辽宁分离物Beipiao（HE818412）一致率最高,分别为98.9%和99.6%;HEB2与云南分离物Chuxiong1（HE818417）一致率最高,为97.1%。HEB1是MDJ和HEB2的重组体。在根据全基因组序列构建的系统进化树中,TMV分为3个组,其中HEB1和MDJ均属I（U1）组,HEB2属Ⅱ（Rakkyo）组。TMV的4个基因均处于负选择,其中衣壳蛋白基因的选择压力最大。      

拮抗细菌对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究

从发生烟草花叶病毒(TMV)的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株By33和By88。生物测定试验表明,By33和By88的无菌发酵液对TMV的体外抑制作用分别为81.81%和83.29%,涂抹菌液24 h后接种TMV,仍有73.01%和66.98%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白;拮抗蛋白对TMV的体外抑制作用分别为85.38%和87.47%,并且在274.00 nm处有明显的蛋白吸收峰,为典型的蛋白质吸收光谱。此外,通过叶圆片法和透析法生物测定表明,抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆,有抑制TMV在烟株体内复制的作用。     

烟草普通花叶病毒抗血清的吸附纯化及应用

为了检测烟草普通花叶病毒(TMV),使用提纯病毒免疫小白鼠,制备TMV抗血清,对抗血清进行了吸附纯化,并建立了基于自制TMV抗血清的ELISA检测体系.蛋白电泳研究结果表明,提取的TMV纯度和浓度都很高;经过烟草总蛋白吸附纯化后,有效去除了非特异性反应;通过效价测定,确定TMV抗血清的效价高达1:40960;正交连续稀释法确定的ELISA检测最佳试剂浓度为:酶标二抗稀释度1:20000,TMV抗血清稀释度1:2000,病叶样品的稀释度为1:20.     

蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组测序及生物学特性分析

目的：通过全基因组测序和生物信息学,研究前期筛选可降解高效氯氰菊酯（β-CY）蜡样芽孢杆菌GW-01的基因组序列信息和生物学特性,为其安全性评估提供参考。方法：利用HPLC验证了GW-01降解β-CY的能力。GW-01的整个基因组基于二代Illumina NovaSeq与三代PacBio Sequel测序平台相结合的测序技术,对菌株GW-01进行全基因组测序,并对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、碳水化合物活性酶预测、毒力因子和抗生素抗性分析,此外,还基于gyrA基因序列对菌株GW-01构建系统发育树。结果：GW-01在第6 d可降解48.4%的β-CY;GW-01菌株全基因组大小为5244145 bp,基因组类型为环状,平均GC含量36.43%,共编码5314个基因,含有104个tRNA基因,313个ncRNA,GW-01菌株全基因组序列在GO、KEGG、COG、NR和Swiss-Prot、CAZy、VFDB、CARD数据库分别注释到基因3536、4714、4434、5290、3854、135、263和96个,GW-01与其他四个近缘菌株相比显示出高GC含量,并且毒力因子和...     

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出。卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病。      

烟草黄瓜花叶病毒湖北分离物全基因组序列分析及亚组鉴定

为明确我国湖北烟区烟草黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的亚组类型,对湖北地区侵染烟草的CMV HB24株系进行基因组全长克隆和序列分析。结果表明,HB24株系RNA1(GenBank序列号:KC019299)全长为3363个核苷酸(nt),编码993个氨基酸的1a蛋白;RNA2(GenBank序列号:KC019300)全长为3049nt,编码859个氨基酸的2a蛋白和111个氨基酸的2b蛋白;RNA3(GenBank序列号:KC019301)全长为2216nt,编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP蛋白。核苷酸序列同源性分析表明,HB24与Fny,SD和Q株系RNA1同源性分别为91.6%,91.1%和75.9%,RNA2同源性分别为91.8%,97.8%和69.5%,RNA3同源性分别为92.1%,93.4%和73.2%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)ER株系RNA1,RNA2和RNA3的同源性分别为65.5%,56.7%和54.1%,与同属番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)V株系同源性分别为66.9%,57.7%和51.5%。HB24 RNA3 5′NTR(Nontranslated region)的结构分析以及RNA3 5′NTR和CP基因核苷酸序列系统进化树的分析表明,HB24属于CMV亚组IB。     

烟草脉带花叶病毒云南分离物全基因序列分析

应用电子显微镜负染色法在烟草叶片斑驳、脉间褪绿病样中观察到马铃薯Y病毒属病毒粒子,通过马铃薯Y病毒属兼并引物扩增获得目的片段,序列分析表明病样中病原物为TVBMV,命名为YN-YX-TVBMV。根据GenBank已知序列,分别合成引物,对YN-YX-TVBMV进行克隆及测序,得到一条6047 bp的不完整的病毒基因组核苷酸序列,将该序列与国内报道的TVBMV全基因序列进行对比分析发现该分离物与报道的TVBMV其他分离物具有明显的地域分布差异,即云南获得的分离物均独立聚为一簇。     

生防菌复配对烟草黑胫病的防治效果研究

为解决单一生防菌防效不稳定问题,通过平板对峙试验、相容试验、盆栽试验从6株生防菌中筛选对烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）具有较高拮抗活性的复配菌株组合;利用分子生物学方法对各菌株的16S rRNA和gyrA基因进行系统进化分析,鉴定各菌株分类地位;并采用轮换因子法筛选各菌株的最适发酵培养基。结果表明,GY1、GY10和GY12发酵后混合施用对烟草黑胫病的防治效果最好,平板抑菌率达到86.9%,盆栽防效为74.53%,比GY1、GY10、GY12单独处理分别提高15.34%、27.42%和44.94%;分子鉴定表明,3株菌分别为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;并筛选得到了GY1、GY10、GY12的最适发酵培养基,发酵24 h后生物量相较于基础培养基分别增加了75.12%,92.31%和194.55%。     

烟草青枯病抗性的全基因组关联分析

为发掘并定位烟草青枯病抗性遗传位点,利用RAD简化基因组重测序技术（RAD-seq）,以219份遗传多样性较高的国内外烟草品种作为供试自然群体,利用田间病圃鉴定供试材料的青枯病抗性,通过全基因组关联分析（GWAS）,发掘抗病基因组区段,并进行抗病候选基因预测。结果表明,筛选鉴定到8个高抗青枯病的烟草品种,获得了384 904个高质量的SNP位点,对烤烟群体的基因组连锁不平衡衰减（LD）距离进行了估算,平均为256 kb。在烟草基因组内发掘到1个与烟草青枯病抗性变异显著关联的区段,峰值SNP在17号染色体的23 977 382 bp处,p=6.196×10^-7,能解释14.29%的表型变异,在该区段内预测到4个抗病候选基因。本研究为烟草青枯病抗病基因克隆及分子育种提供了较为明确的基因组定位信息。     

烤烟烟碱含量的全基因组关联分析

烟碱是烟草属特有的一类生物碱,为加深对烟碱遗传调控机制的解析,充分挖掘高烟碱优异等位。本研究选取219份烤烟品种开展了RAD重测序研究,获得了384,904个高质量SNP位点的群体分型数据。同时在四川西昌和山东诸城2个试验点,于2012-2015年相同栽培管理条件下对供试品种的烟叶烟碱含量进行了表型鉴定。利用全基因组关联分析的策略,共发掘到2个与烟碱含量显著关联的SNP位点,分别位于1号染色体的69,912,063bp处和2号染色体的81,115,794bp处。基于上述SNP位点预测到2个候选基因,并将目标SNP位点转化3对可通过PCR检测的功能标记。通过以上研究,加深了烟碱遗传调控机制的解析,为高烟碱优异等位基因型的发掘和高烟碱新品种的分子标记辅助选择提供了可用的标记和基因资源。      

一株烟草花叶病毒生防细菌的鉴定及代谢物活性研究

从烟田土样中分离到1株对TMV有拮抗作用的细菌By33,通过形态观察、生理生化试验及16SrDNA同源性序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。通过对By33代谢产物对TMV抑制作用测定发现,其代谢物质对温度敏感,80℃处理30min,丧失大部分活性,遇酸沉淀,碱性条件下稳定,对蛋白酶不敏感。     

风干肉中产脂肪酶瑞士乳杆菌TR13全基因组测序及序列分析

瑞士乳杆菌TR13是从自然风干羊肉中分离筛选到的1株产脂肪酶活性高的菌株,为能够更好地研究该菌株在羊肉发酵过程中的代谢机理和功能,采用PacBio Illumina HiSeq测序平台对细菌TR13进行完成图测序分析。结果表明,瑞士乳杆菌TR13基因组为1套环状无质粒分子,基因组序列总长度为2 172 224 bp,GC含量为36.82%。基因组中预测到2 536个编码基因,编码基因总长度为1 883 532 bp,平均长度为799.46 bp,平均密度为1.08个/kb,对应蛋白质平均序列长度为265 aa,占基因组百分比为86.71%。TR13菌株基因组中包含15个rRNA操纵子和63个tRNA。预测到可能的毒力基因75个,耐药基因150个。编码基因通过GO、COG和KEGG数据库的对比分析,完成了TR13菌株基因组基本功能注释和代谢通路基因信息注释,注释信息可为菌株应用研究提供一定理论依据。     

1株产VB12球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1的分离、全基因组测序及分析

为深入探究球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1(LysinibacillussphaericusC5.1)菌株产VB₁₂的作用机制,利用PacBio Sequel和Illumina NovaSeq PE150相结合的方法对C5.1菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行拼接、基因预测及功能注释。结果表明,C5.1菌株基因组为一个环状DNA,不含质粒,大小为4 690 817 bp,GC含量为37.21%,预测得到4 756个编码基因,111个tRNA基因和34个rRNA基因。通过基因本体论、直系同源集、京都基因与基因组百科全书和转运蛋白分类数据库对C5.1菌株基因组进行注释分析,分别匹配到3 095、3 182、4 374个和397个基因。进一步分析发现C5.1菌株基因组中包含从尿卟啉原Ⅲ逐步转化合成VB₁₂的关键酶。本研究为解析C5.1菌株在臭腐乳发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础,也为今后开展发酵食品中VB₁₂的生物合成机制研究提供理论支撑。     

烟草根结线虫病生防菌株TB-68的鉴定及室内防效测定

为寻求新的烟草根结线虫生防资源,通过形态学特征和16S rDNA分析对前期分离到的1株根结线虫生防细菌TB-68菌株进行种类鉴定,并通过室内离体活性测定和盆栽试验研究了TB-68菌株对烟草根结线虫病的防治效果.鉴定和研究结果显示,TB-68菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),该菌株发酵滤液原...     

几种药剂对烟草漂浮苗干根中烟草花叶病毒的失活效果

为了提出烟草漂浮育苗旧苗盘残留物中烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的消毒方法,采用接种枯斑寄主和接种普通烟K326方法,测定了几种药剂对病苗干根中TMV的失活效果。结果表明,98％磷酸三钠25 g/L 和50 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖2～3 d 可彻底失活病苗干根中的TMV,40％育宝6.7 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖3～4 d对病苗干根中TMV失活效果高,推荐这两种药剂用于旧苗盘TMV消毒。下列消毒溶液处理对病苗干根中TMV不能完全失活:美国消毒剂20 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖5 d、2％二氧化氯10 g/L溶液、7%有效氯次氯酸钠10 g/L溶液、高锰酸钾3.3 g/L溶液和30%有效氯漂白粉50 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖7 d。上述药剂消毒旧苗盘TMV的浓度和处理方法需要进一步试验。抗病毒剂2%菌克毒克1.7 g/L溶液、3.95%病毒必克2.0 g/L溶液、24％毒消1.7 g/L溶液都不适宜于旧苗盘TMV浸泡法消毒。与药剂浸湿后塑料膜覆盖方法相比,药剂浸泡法的可操作性差。三抗体夹心法和TMV试纸条检测结果表明,上述药剂浸泡30～120 min和浸湿后塑料膜覆盖8 h～7 d后,不能有效破坏干病根样品中TMV抗原。