烟草腺毛发生和发育相关基因

烟草(Nicotiana tabacum L.)腺毛丰富、类型多样、分泌旺盛,对烟株抗性和烟叶香气品质具有重要影响。对近年来烟草腺毛发生和发育、腺毛分泌物合成相关基因的研究进展进行了综述,并展望了其在烟草叶面化学定向调控和品种改良中的应用潜力。     

烟草腺毛发育的形态学研究

采用显微技术,对不同发育时期烟草叶面腺毛的形态变化和超微结构进行了观察,将腺毛发育过程划分为生长期、成熟期和分泌期3个阶段.生长期腺毛进行旺盛的细胞牛长和分裂活动,细胞质浓厚,线粒体叶绿体丰富,基粒片层清晰;成熟期腺毛形态发育完成,细胞数目稳定,叶绿体内基粒片层消失,嗜锇颗粒逐渐增多、增大,表明细胞开始进行活跃的物质合成和转化;分泌期腺毛细胞黏性增大,叶绿体降解,嗜锇颗粒进入细胞质并转运至液泡中积累,细胞开始降解,细胞质稀薄,大最嗜锇物质聚集在质膜附近.     

NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

烟草腺毛是烟草表皮细胞的特化结构,对烟株抗性及烟叶品质具有重要影响。为探索烟草腺毛密度的分子调控途径,本文对烟草B型细胞周期蛋白基因NtCycB2进行了同源克隆和生物信息学分析,并对其表达特性和生物学功能进行研究。结果表明该基因包含333bp的编码区,编码110个氨基酸,该序列在栽培烟草不同类型、不同品种间高度保守,但与SlCycB2和AtCycB2同源性分别为71.05%和52.38%。RT-PCR分析表明NtCycB2在叶面腺毛和花中的表达水平较高,并受到盐、温度、MeJA等逆境信号的诱导;分别利用基因过表达和基因编辑技术获得了NtCycB2过量表达和敲除株系;植株腺毛形态学观察发现NtCycB2过表达植株腺毛密度显著减少,基因敲除植株分泌型腺毛密度显著增加,而非分泌型腺毛变化不大,该研究表明NtCycB2对烟草分泌型腺毛发生具有明显的负调控作用,在烟草腺毛密度分子调控和叶面化学定向改良中具有较大潜力。      

不同烟草种质腺毛密度鉴定分析

为筛选高腺毛密度种质资源供烟草育种利用,加快香气性状遗传改良步伐,本研究共观察了110份材料的长短柄腺毛,并统计其密度。结果表明,各品种长短柄腺毛的长短、腺头大小、密度均不一致;短柄腺毛、长柄腺毛和总腺毛密度的变异系数分别为25.4%、29.3%和23.4%,试验材料存在广泛变异;短柄腺毛密度、长柄腺毛密度和总腺毛密度比对照MSK326多的材料数分别为34份、17份和19份,其中共有的材料数为11份;总体上,叶片上表面的短柄腺毛密度大于下表面,叶片下表面的长柄腺毛密度大于上表面,上下表面的总腺毛密度差异没有一致规律,叶片长柄腺毛密度要大于短柄腺毛,但存在个别特异材料与该规律相反,这些材料基本为地方种质;聚类分析结果显示,在阈值为4时,可以将110份材料分为5类,除特殊的B类外,其他几类的腺毛密度大小为A > C > E > D;云烟116、V2、红花大金元、席娄烟等可以作为高腺毛密度材料,为育种利用提供参考。     

不同基因型烟草腺毛主要分泌物差异分析

为明确不同基因型烟草腺毛分泌物的成分差异,筛选高腺毛分泌物基因型的烟草种质,本研究基于气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）,对不同基因型的12个烟草品种的鲜烟叶腺毛主要分泌物进行鉴定分析,结果表明:在12份检测品种烟叶中,西柏三烯二醇（CBT-diols）是西柏烷二萜的主要物质形式,且其在烤烟品种中含量相对较高;所有检测品种中均含有α-西柏三烯二醇（α-CBT-diols）和β-西柏三烯二醇（β-CBT-diols）,两者比值变化范围为1.58~2.32;所有检测品种中共检测出5个蔗糖酯类型,可依据蔗糖酯类型的有无和含量的多少将检测种质分为Ⅰ-Ⅱ型蔗糖酯较多和Ⅲ-V型蔗糖酯较多2个大类。总体上看,Basma、Beinhart1000-1、红花大金元、BX1、BX2这5个品种腺毛主要分泌物含量较高,可供烟草香气品质改良育种或表面活性物质提取利用。      

烟草腺毛优势表达基因NtMYB108b的克隆及分析

为揭示NtMYB108转录因子在烟草中的功能,从栽培烟草K326的叶片腺毛中克隆到1条MYB基因的全长cDNA序列,命名为NtMYB108b。NtMYB108b的开放阅读框为828 bp,编码275个氨基酸。生物信息学预测显示,NtMYB108b蛋白定位于细胞核,属于R2R3-MYB型转录因子S20亚组成员,与绒毛状烟草亲缘关系最近,序列相似性为100.00%。实时荧光定量PCR分析显示,NtMYB108b在烟草腺毛中优势表达;NtMYB108b在团棵期叶片中相对表达量最高,在现蕾期5个叶位中的表达无显著差异。经乙烯利（ET）和水杨酸（SA）处理后,NtMYB108b的表达量显著上调,而经茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）处理后其表达量无显著变化;使用聚乙二醇（PEG）处理模拟干旱胁迫,处理2 d后NtMYB108b表达量上调,这说明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信号转导和干旱胁迫。     

分泌型烟草腺毛形态和叶面化学成分的比较

西柏烷二萜和蔗糖酯是腺毛分泌物的主要成分.为了明确不同类型腺毛的分泌物差异,以不同腺毛类型的烟草品系TI1068和TI35为材料,分析了表皮毛的形态结构、叶面化学成分、西柏烷二萜合成基因的表达水平以及蚜虫的嗜好性.表皮毛形态学观察发现,TI1068和TI35同时具有长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛3种表皮毛类型;TI1068...     

低浓度茉莉酸甲酯对烟草长柄腺毛发生发育的影响

茉莉酸甲酯（MeJA）对烟草长柄腺毛的发生具有强烈的诱导作用,但浓度过高时会抑制烟苗发育。本文以云烟87幼苗为材料,研究低浓度MeJA对腺毛发育和腺毛分泌物的影响,并利用qRT-PCR技术研究腺毛发生发育调控基因对MeJA的应答模式。结果表明,随着MeJA喷施浓度的升高,长柄腺毛的密度和腺头直径逐渐增加;喷施300μmol/L MeJA对长柄腺毛发生和发育有显著的诱导作用,且对叶片发育无明显影响;当MeJA喷施浓度达到600μmol/L时,叶片发育受到抑制。叶面化学成分分析发现,与未喷施MeJA的对照相比,喷施300μmol/L MeJA后西柏烷二萜、烷烃和蔗糖酯含量增加约一倍。基因应答模式研究发现,西柏烷二萜合成基因CBTS和CYP71D16,以及酯转运蛋白基因Nt LTP1受MeJA诱导表达;烟草腺毛发生调控基因ARF3、GIS、CD2、Wo和Cyc B2对MeJA处理均具有应答反应,其中ARF3和GIS的表达受到MeJA诱导,而CD2、Wo和Cyc B2的表达受到MeJA抑制。综上,300μmol/L MeJA可以调控腺毛发育相关基因的表达,安全、有效地促进长柄腺毛发生发育以及腺...     

典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

以烟草品种K326为材料,分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川三个典型生态区,在烟草叶片发育过程中对叶面腺毛形态、密度、腺毛分泌物及基因表达水平进行了比较研究。显微观察发现腺毛类型在3个地区间变化不大,都以长柄多腺头腺毛为主,但腺毛密度以贵州遵义产区的烟叶最高,河南次之,云南最低;GC/MS检测表明,西柏三烯二醇含量以河南产区为最高。且河南和云南产区随叶龄变化趋势相同;RT-PCR分析表明,西柏烷类化合物合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16转录水平的表达与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。该研究表明生态环境对烟草腺毛发育和物质代谢具有较大影响,典型生态区烟叶叶面化学的差异可能与烟叶的风格特色密切相关。      

烟草腺毛生物反应器材料的创制与性状分析

为提高烟草腺毛分泌物含量（质量分数）,以高分泌型种质资源T.I.1068为材料,采用基因编辑技术敲除其腺毛发育负调控基因NtCycB2,获得了纯合突变株系TTB-1(tobacco trichome bioreactor-1)。结果表明：TTB-1植株生长旺盛,发育正常。显微观察发现与烤烟K326不同,TTB-1与T.I.1068表皮毛由腺毛组成,无保护毛;TTB-1腺毛密度比T.I.1068提高53.41%,是K326的7倍;与K326相比,TTB-1腺头更加饱满,罗丹明着色更深。烟株现蕾期中部叶片叶面化学成分检测结果显示,TTB-1与T.I.1068分泌物组分一致,但分泌物含量显著高于T.I.1068,分泌物总量比T.I.1068提高63.11%;TTB-1与K326分泌物组分不同,除西柏烷类二萜和Ⅰ～Ⅱ型蔗糖酯外,还含有赖百当类二萜和Ⅲ～Ⅴ型蔗糖酯,总量是烤烟品种K326的7.95倍。对上中下部成熟叶片进行分批采收和叶面化学成分萃取,浸膏产率分别为烟叶鲜质量的0.61%、0.43%、0.30%,平均每株浸膏产量为8.90 g;在盛花期进行一次性采收,浸膏产率为烟叶鲜质量的0.45...     

中介体亚基基因NtMed8在烟草花期调控中的作用

为研究NtMed8对烟草花期的影响,调查了NtMed8基因RNA干扰(RNAi)转化烟草植株在短日和长日下的花期,发现短日下NtMed8-RNAi植株花期比对照显著延迟,而长日下却比对照显著提早。为探讨NtMed8调节花期的可能分子机理,以实时定量RT-PCR方法分析了与烟草花期调节相关的5个基因在烟草3个组织的表达水平。结果显示,NFL1在烟草茎尖和幼蕾里表达水平较高,其它4个基因均在幼蕾里表达最强。不同遗传类型检测结果表明,与对照植株相比,无论在长日或短日条件下,在RNA干扰植株中NtSOC1的表达量都显著降低;NFL1和NtAP1-2在长日下的表达量显著升高;NtMADS4在短日下显著下调;NtFUL在短日和长日下的表达水平没有显著变化。说明NtMed8在烟草生长发育过程中通过调节其它花期基因的表达调控烟草的花期,是烟草花期调节的重要功能基因。     

NtLTP2基因在烟草根系发育中的功能分析

为阐明烟草NtLTP2基因在烟草生长发育中的功能,以云烟87为试验材料,克隆了NtLTP2基因的编码区和启动子序列,分别对其进行生物信息学预测、启动子组织驱动特性分析,以及基因功能研究。结果表明NtLTP2基因编码区全长294 bp,编码97个氨基酸;NtLTP2具备nsLTP2和AAI-LTSS超家族保守域,蛋白质三级结构包含1个由4个α-螺旋组成的脂质疏水腔。烟草NtLTP2为根部优势表达基因,其启动子能够驱动下游基因在烟草根部特异表达。NtLTP2过表达烟草株系的侧根数目约为对照的2倍,根系的总长、总表面积和总体积均显著增加,并且地上部分的生长发育明显优于对照。     

烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

烟草叶片腺毛发育及其分泌活动对烟叶品质的影响

对烤烟NC89和庆胜2号及香料烟沙姆逊叶片的解剖学观察表明:不同烟草类型(品种)间,叶片腺毛密度和类型有明显差异。腺毛密度随叶片的发育而减少,随叶位的升高而增加。品种间叶片腺毛密度:沙姆逊>NC89>庆胜2号。叶片成熟时腺毛密度最高。多细胞腺头比单细胞腺头分泌物多。     

茉莉酸甲酯对烟草分泌型和非分泌型腺毛形态发生的影响

为解析茉莉酸对烟草腺毛发生的影响,本文以高分泌型普通烟草T.I.1068和非分泌型普通烟草T.I.1112为材料,喷施不同浓度茉莉酸甲酯（MeJA）,并对处理前后的叶片和茎表面腺毛进行形态学比较观察。结果发现:（1）T.I.1068腺毛包括长柄分泌型和短柄分泌型两类,腺毛密度随着MeJA浓度的增加而增加,但腺毛类型保持不变。（2）T.I.1112腺毛包括非分泌型和短柄分泌型两类,长柄分泌型腺毛在MeJA处理后出现,其密度随MeJA浓度的增加而增加,而非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的密度并无明显变化。该结果表明,MeJA对烟草长柄分泌型腺毛发生具有强烈的诱导作用,而对非分泌型腺毛的发生并无明显影响,反映出不同类型的烟草腺毛具有不同的发生调控机制。      

普通烟草品种生长发育过程中叶表腺毛密度及其形态的比较

以6个普通烟草品种为试验材料,比较了烤烟、白肋烟、晒烟和晾烟品种间及同一品种的不同发育时期烟草叶表不同部位腺毛形态、密度的差异.结果表明:几种供试烟草品种在生长发育过程中的腺毛类型主要有长柄腺毛、短柄腺毛和无头腺毛,但在烟草整个发育过程中始终以长柄腺毛为主.从烟草现蕾期开始,部分长柄腺毛的头部开始萎缩、脱落,形成无头腺毛.几种供试烟草品种从移栽期开始腺毛密度逐渐增加,到现蕾期腺毛密度达到最大值,成熟期又明显下降.烟草叶片上表面的腺毛密度均大于下表面,但叶尖、叶中部和叶基部的腺毛密度没有明显差异.     

水分胁迫对烤烟腺毛超微结构的影响

采用透射电子显微镜技术,研究了水分胁迫下烤烟叶片腺毛腺头细胞超微结构的变化。正常灌水条件下,腺头细胞细胞器丰富,细胞质浓厚,液泡中存在电子致密度高的黑色嗜锇颗粒;轻度干旱情况下,腺头细胞中细胞器含量较少,液泡也相应增大,电子致密度高的黑色嗜锇物质有增多趋势;干旱情况下,腺头细胞中细胞器极少,细胞质极少或无,电子致密度高的黑色嗜锇物质较多,有些腺头细胞内部已基本降解。结果表明水分丰缺对腺毛的超微结构有较大影响。     

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

转录后基因沉默(PTGS)与烟草抗病毒育种

对转录后基因沉默的特点和发生机制、PTGS与植物病毒抗性等方面进行综述,并在此基础上,就该技术策略应用于烟草抗病毒育种上的可行性进行探讨,并提出相关建议。