海藻糖合成酶活性测定方法的研究

目的 研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法.方法 用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖,用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖,DNS法测定还原糖,差值法计算海藻糖合成酶活性.结果 获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法,成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性.结论 此方法设备简单,易于同时测定较多的样品,适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定.     

海藻糖合成酶活性测定方法的研究

目的 研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法.方法 用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖,用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖,DNS法测定还原糖,差值法计算海藻糖合成酶活性.结果 获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法,成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性.结论 此方法设备简单,易于同时测定较多的样品,适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定.     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

毕赤酵母展示海藻糖合成酶及其性质研究

利用毕赤酵母表面展示天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)海藻糖合成酶(Trehalose synthesase,TS,EC 5.4.99.16)并研究其酶学性质。人工合成酵母内源壁蛋白(GPI-modified wall proteins,GCW14)与天蓝色链霉菌海藻糖合成酶组合DNA(GCW14-TS),将其亚克隆到pPIC9k载体后转化到GS115酵母菌中,成功构建了pPIC9k-GCW14-TS载体,并将TS展示在毕赤酵母GS115表面,然后对其酶学性质进行研究。发现其在30~45℃温度范围都能发挥作用,最适pH为8.5,K~+、Mg~(2+)等金属离子对其有促进作用且重复使用5次后仍然可以保持75%以上的酶活性。该基因工程菌具有海藻糖合成酶固定化酶性质,可用于将麦芽糖转化为海藻糖的产业化生产。     

谷氨酸棒杆菌ATCC14067海藻糖合酶基因的克隆及功能鉴定

海藻糖分子是由2个吡喃葡萄糖环以α,α-1,1-糖苷键连接而成的一种十分稳定的非还原二糖,由于其特殊的生物学保护功用,广泛应用于医药、化妆品、食品等多个领域,具有很好的市场前景。目前,海藻糖的生产方法以生物酶法制备为主。其中,利用Tre Y-Tre Z途径由淀粉生产海藻糖和利用Tre S途径由麦芽糖生产海藻糖最为经济可行。针对谷氨酸棒杆菌ATCC14067的海藻糖合酶基因(tre S)进行基因克隆,将其插入表达质粒p ET-22b,在宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,成功得到特异表达的目的蛋白。经高效液相色谱检测证实,该重组酶作用于麦芽糖后,可以产生海藻糖,具有海藻糖合酶的相应活性。在最适反应条件(30℃,p H7.5)下海藻糖合酶的转化效率可达60%~70%。实验系统地对谷氨酸棒杆菌ATCC14067的海藻糖合酶基因进行了异源表达及酶学性质的研究,为其大规模生产及工业化应用奠定了基础。     

密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平

目的优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平。方法基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1。基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平。结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8%降低至54.4%,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3%以上。结论密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考。     

极地微生物产海藻糖合成酶菌株的筛选

来源于极地的微生物经过筛选,得到能产海藻糖合成酶的耐冷菌株S1和S2,分别用TLC、DNS和HPLC的方法确证其酶反应的产物为海藻糖.以质量分数1%麦芽糖为底物,S1粗酶液能将麦芽糖转化为海藻糖,并且没有明显的葡萄糖生成,在pH值7.0的磷酸盐缓冲液下15℃反应48h,经过HPLC测定转化率最高达到75.2%.     

基于DO-stat流加培养控制的海藻糖合成酶发酵条件研究

溶氧浓度对重组大肠杆菌的生长和外源蛋白的高效表达影响较大,为进一步增加菌体量和重组蛋白表达量,该研究采用DO-stat流加培养进行控制,分别研究了溶氧浓度20%、30%、35%和40%条件下大肠杆菌的生长情况以及海藻糖合成酶的表达情况。结果表明,当发酵罐中溶氧浓度控制在30%时,发酵40 h,菌体干质量可达53.9 g/L,是分批发酵时的6倍,海藻糖转化率达到80.9%,是分批发酵时的2.25倍。     

不同抗冻剂对冻藏鲢鱼滑品质特性的影响

为延缓冻藏过程中鱼滑品质的劣变,以鲢鱼为原料制备鱼滑。通过测定凝胶强度、盐溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性等指标,评价海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇3种抗冻剂对鱼滑品质的冻藏保护效果。结果表明：通过试验确定海藻糖、麦芽糖醇和山梨醇的总添加比例为6%（质量分数）,此时鲢鱼滑具有较高的凝胶强度,其盐溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性明显增高;通过配方均匀设计试验,得出复配抗冻剂的最适添加量为：海藻糖16%,麦芽糖醇22%和山梨糖醇62%（质量分数）。将此抗冻剂添加到鲢鱼滑中做90 d稳定性试验,对比空白组,在冻藏期间添加抗冻剂能有效减缓鲢鱼滑的品质劣变,防止蛋白质的冷冻变性。     

海藻糖合成酶诱导条件优化研究

采用乳糖诱导大肠杆菌产海藻糖合成酶,用以转化麦芽糖为海藻糖,利用高效液相色谱法测定海藻糖的转化率。采用单因素试验和正交试验研究乳糖诱导时的pH、温度、转速和持续时间四个因素对海藻糖转化率的影响,寻找大肠杆菌产海藻糖合成酶转化海藻糖的最优条件组合,为海藻糖工业化生产提供参考依据。结果表明,诱导温度和持续时间对海藻糖转化率的影响较大,海藻糖合成酶最佳诱导条件为:pH 7.4、温度26℃、转速500 r/min、诱导时间10 h。在最佳条件下,海藻糖的转化率可达69.45%。